黃芪治療肺脾氣虛型直腸內(nèi)脫垂的療效及機制研究?

萬星陽，金 鑫，許裕杰，蘇 丹，張 恒，孫逸洲，任東林△

(1. 中山大學附屬第六醫(yī)院，廣州 510655； 2. 廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣州 510405)

直腸內(nèi)脫垂是發(fā)生于排便時，近側直腸黏膜或全層向內(nèi)套入到遠端腸腔或肛管內(nèi)而未脫出肛門外，并在排便后持續(xù)存在的一種疾病，也稱隱性直腸脫垂或直腸套疊[1]，是出口梗阻型便秘常見的合并癥。Gladman等研究發(fā)現(xiàn)，約1/3的出口梗阻型便秘患者出現(xiàn)直腸感覺功能異常[2]，主要表現(xiàn)為直腸敏感性降低，直腸便意閾值和最大耐受閾值增高，即直腸壓力感覺功能異常，從而影響直腸的排便過程。Piezos蛋白家族中的Piezo2蛋白是直腸黏膜上的壓力感受性離子通道，其表達水平對直腸感覺功能起重要作用。

直腸內(nèi)脫垂的中醫(yī)病機為中氣不足、清陽下陷，濁清升降失調(diào)，直腸推動無力。補中益氣湯通過補脾益氣達到升陽舉陷之效，用于治療氣虛型慢性功能性便秘療效獨特。本研究旨在比較服用不同劑量黃芪的補中益氣湯治療肺脾氣虛所致直腸內(nèi)脫垂療效，研究黃芪在治療過程中的作用。為此進行了初步的臨床試驗研究，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究觀察病例為2017年1月至2017年8月中山大學附屬第六醫(yī)院和廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院肛腸科收治住院的30例肺脾氣虛型并欲行手術治療的直腸內(nèi)脫垂患者，并隨機納入10例無合并便秘癥狀及直腸內(nèi)脫垂的行混合痔直腸內(nèi)脫垂黏膜切除術(procedure for prolapsing hemorrhoids, PPH)治療的混合痔病患者作為空白對照組，所有入組患者均符合入組標準。本研究已獲得中山大學附屬第六醫(yī)院倫理委員會批準，患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 診斷標準

所有患者均符合《中醫(yī)外科學》第9版[3]肺脾氣虛型所致直腸內(nèi)脫垂患者診斷標準：便時肛內(nèi)腫物脫出，輕重程度不一，色淡紅；伴有肛門墜脹、大便帶血、神疲乏力、食欲不振甚者頭昏耳鳴、腰膝酸軟；舌淡苔薄白、脈細弱且無手術禁忌癥。

1.3 納入標準

空白對照組年齡18～70 周歲；無合并便秘癥狀和直腸內(nèi)脫垂的混合痔患者；患者無其他嚴重合并癥，可耐受手術并簽署知情同意書。試驗組年齡18～70 周歲；直腸內(nèi)脫垂患者且符合第9版《中醫(yī)外科學》肺脾氣虛型診斷標準；患者對補中益氣湯各成分無過敏反應；患者無其他嚴重合并癥，可耐受手術并簽署知情同意書。

1.4 排除標準

妊娠、哺乳期婦女；合并其他肛腸疾患，如肛瘺、肛裂、消化道腫瘤、慢性直腸炎等；合并其他全身性疾病者。

1.5 分組與治療方法

對照組與實驗組均行PPH術，術中留取臨床組織標本。根據(jù)中藥干預情況的不同，將30例實驗組患者按照隨機數(shù)字表法分為實驗組1(無中藥治療+PPH)、實驗組2(30 g黃芪的補中益氣湯+PPH)和實驗組3(60 g黃芪的補中益氣湯+PPH)3組各10例。實驗組1不服用中藥；實驗組2的方劑組成：黃芪30 g，人參9 g，當歸12 g，陳皮9 g，升麻15 g，柴胡6 g，白術12 g，甘草6 g；實驗組3的方劑組成：黃芪60 g，人參9 g，當歸12 g，陳皮9 g，升麻15 g，柴胡6 g，白術12 g，甘草6 g。后2組補中益氣湯均水煎每日1劑，早晚飯前服，治療時間為30 d。

1.6 臨床療效評價

參照2012年中華中醫(yī)藥學會制定的《中醫(yī)肛腸科常見病診療指南》[4]制定標準：1分：肛門無明顯不適；3分：偶有肛門墜脹感；5分：肛門時有墜脹疼痛，不影響生活工作；7分：有肛門墜脹疼痛，對正常生活工作有一定影響；9分：肛門墜脹疼痛，不能正常生活工作。參照國外相關文獻[5]，采用Longo便秘評分對肺脾氣虛所致直腸內(nèi)脫垂合并便秘嚴重程度進行量化。采用上述2種評分方法對所有納入研究的患者在中藥干預前、中藥干預后、術后半年、術后1年分別進行療效評價，觀察其服藥后、手術后的臨床療效。

1.7 Western blot法測定直腸組織壓力感受器蛋白Piezo2的表達水平

標本采集：所有患者均于術中留取臨床組織標本，標本均為無菌條件下行PPH術后患者的直腸黏膜組織，所有組織取材長度約0.3～0.5 cm，離體30 min內(nèi)無菌條件下立即置于-80 ℃冰箱或液氮中保存?zhèn)溆谩嶒灧椒ǎ喝?0～100 mg組織塊經(jīng)液氮粉碎，加入800μL RIPA裂解液[50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA，1%Triton X-100，1%sodiumdeoxycholate，0.1%SDS, 1 mmol PMSF]，冰上勻漿。裂解反應30 min后，4℃ 12000 r/min離心10 min，取上清裝于0.5 ml EP管中，分裝后-70 ℃保存?zhèn)溆谩CA法測蛋白含量，取蛋白樣品各50 μg上樣，經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入Piezo2 Antibody (1∶1000，Novus Biologicals USA)，4 ℃結合過夜。用15 ml TBST漂洗3次，每次5 min。將膜置于1∶5000辣根過氧化酶偶聯(lián)的山羊抗兔二抗(北京中杉金橋)，搖動1 h，然后用15 ml TBST洗膜3次，加入ECL顯色，暗室曝光顯示條帶。UVP凝膠成像系統(tǒng)掃描成像，比較Piezo2條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值，評估Piezo2蛋白的表達水平。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 患者基線資料比較

表1示，對照組與試驗組之間年齡、性別組成、身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)比較差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)，具有可比性。對照組與試驗組比較，分別在肛門墜脹評分、Longo便秘評分上差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 空白對照組與實驗組各亞組均衡性比較分)

2.2 不同黃芪劑量補中益氣湯治療前后患者臨床癥狀評分比較結果

表2示，實驗組2和實驗組3患者服用補中益氣湯1個月后，肛門墜脹和Longo便秘評分較服藥前均有改善，除實驗組2服用的前后肛門墜脹評分改變差異無統(tǒng)計學意義外，其余比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 實驗組2和實驗組3中藥干預后Longo便秘評分和肛門墜脹評分變化

2.3 不同黃芪劑量補中益氣湯干預后患者術后臨床癥狀評分比較結果

圖1示，手術干預后，實驗組1、實驗組2和實驗組3患者Longo評分、肛門墜脹評分均較術前有明顯改善(P<0.05)，但組間比較Longo評分和肛門墜脹癥狀評分差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。術后半年至術后1年隨訪結果示，實驗組1、實驗組2和實驗組3 Longo評分較術后半年隨訪結果上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，肛門墜脹癥狀較術后半年隨訪差，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1 各組患者采用中藥干預前、術后半年、術后1年Longo便秘評分和肛門墜脹評分變化比較

2.4 不同黃芪劑量補中益氣湯對患者直腸組織壓力感受器蛋白Piezo2表達的影響

Western blot 結果顯示，以空白對照組的Piezo2相對表達水平(1.04±0.08)、實驗組1(0.75±0.17)，實驗組1明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。不同劑量黃芪補中益氣湯對患者直腸組織壓力感受器蛋白Piezo2的表達分別是：實驗組2(0.702±0.13)，實驗組3(0.67±0.11)。以上結果提示，實驗組2、實驗組3直腸組織壓力感受器蛋白Piezo2水平低于實驗組1，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與實驗組2比較，實驗組3(含60 g黃芪)的直腸組織壓力感受器蛋白Piezo2表達水平稍低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討論

直腸內(nèi)脫垂的病因目前尚未完全明確，致病因素與盆底組織及解剖學異常和或腹內(nèi)壓增高等有關。近年來，“盆腔整體學說”理論逐漸為肛腸科醫(yī)生所接受，直腸內(nèi)脫垂常合并盆底下降，盆底下降的病因病機與中醫(yī)“脾虛五臟失于統(tǒng)攝”“脾主升清”等理論有緊密聯(lián)系。已有研究表明[6]，Piezo2主要定位在直腸黏膜上皮細胞膜上，作為壓力感受器在排便過程中起關鍵作用。前期試驗表明，Piezo2蛋白在便秘患者的直腸黏膜表達較強[7]。因此，實驗中直腸黏膜Piezo2表達上調(diào)，可能是直腸內(nèi)脫垂的病理生理變化的一種表現(xiàn)。

根據(jù)中醫(yī)“脾主肌肉”理論，補益脾氣可以恢復盆底肌彈性，減緩甚至逆轉(zhuǎn)肌肉的退行性改變，達到盆底修復的目的。《中醫(yī)外科學》明確指出，治療脾虛氣陷型內(nèi)痔宜選用補中益氣湯。補中益氣湯原方出自李東垣的《內(nèi)外傷辨惑論》[8]。王夙[9]等研究表明，補中益氣湯聯(lián)合PPH及消痔靈可增加直腸內(nèi)脫垂的治療效果，然而研究未涉及補中益氣湯治療脾肺氣虛型直腸內(nèi)脫垂的機理，亦沒有探討補中益氣湯的治療靶點。

患者服用補中益氣湯1個月后，肛門墜脹和Longo便秘評分相比服藥前有明顯改善，直腸組織壓力感受器蛋白Piezo2表達水平低于未服中藥的對照組，提示補中益氣湯可改善直腸內(nèi)脫垂患者癥狀的作用機理，可能是通過增強腸道的蠕動和盆底肌肉的收縮，促進腸道及盆底肌肉對糞便的推動作用，減少糞便在直腸壺腹的蓄積，從而減輕直腸黏膜組織對壓力感受的負荷，提高直腸黏膜敏感性，在直腸黏膜組織上表現(xiàn)為壓力感受器蛋白Piezo2的下調(diào)，打破糞便蓄積-排便費力腹壓增高-黏膜脫垂加重-出口梗阻加重便秘的惡性循環(huán)，起到“補氣升陽，益氣固脫”的作用。Sun[10]等對直腸黏膜內(nèi)脫垂的患者靜息壓、直腸收縮及球囊擴張狀態(tài)下的肛管直腸內(nèi)壓力的研究結果也從側面印證了這一觀點。本研究中，直腸組織內(nèi)Piezo2蛋白下降程度差異無統(tǒng)計學意義，可能與補中益氣湯預處理時間及人體直腸組織Piezo2蛋白再分布的周期有關，可延長補中益氣湯預處理時間并擴大樣本量進一步驗證。

本研究手術干預后，無論術前有無中藥干預，患者的臨床癥狀均有明顯改善，組間比較差異無統(tǒng)計學意義，提示手術是改善直腸內(nèi)脫垂臨床癥狀的有效方式，目前暫無證據(jù)證明術前使用補中益氣湯可增強手術的短期療效，這與國際同行的研究結果相符[11]。國外相關研究結果顯示，利用吻合器切除部分直腸黏膜治療直腸內(nèi)脫垂短期內(nèi)是安全有效的，但其遠期效果仍待進一步驗證[12]。本研究結果顯示，截止隨訪至術后1年，患者治療效果較術后半年隨訪結果有所下降，其中Longo便秘評分上升有統(tǒng)計學差異，提示單純手術切除堆積的直腸黏膜，便秘癥狀可早期緩解，但患者排便習慣及腸道蠕動狀態(tài)、盆底肌肉等未改善，這些因素可能會影響患者術后長期隨訪結果。值得注意的是，術前中藥干預的患者，其術后臨床癥狀改善程度的下降較單純手術患者緩慢，提示術前使用補中益氣湯，可能對患者術后長期療效有促進作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，采用高劑量黃芪干預的患者，Longo便秘評分和肛門墜脹評分改善程度大于低劑量黃芪干預組，且直腸組織壓力感受器蛋白Piezo2表達水平低于低劑量黃芪干預組，說明黃芪劑量和治療效果可能存在一定關系，推測黃芪可能是影響補中益氣湯中改善患者排便癥狀而影響直腸組織壓力感受器蛋白Piezo2表達的關鍵藥物。但也可能是由于樣本量不足等原因，導致數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學意義。本研究納入的樣本量較少，缺乏5年甚至10年以上的遠期隨訪結果，其遠期結果可待擴大樣本量并長期隨訪后進一步驗證。

綜上所述，手術是改善直腸內(nèi)脫垂患者癥狀的有效方式。不同劑量黃芪的補中益氣湯可改善直腸內(nèi)脫垂術前癥狀，從而影響直腸組織壓力感受器蛋白Piezo2表達程度。術前使用補中益氣湯，可能對維持術后長期療效有促進作用。