電針對功能性消化不良肝郁脾虛模型大鼠十二指腸TLR4、NF-κB p65的影響?

王 丹，張紅星△，榮培晶，侯理偉，李少源，王 瑜，王俊英，張金鈴，趙 斌，國 笑，張 悅，張紫璇，王藝霏，何家愷

(1. 湖北中醫藥大學，武漢 430061； 2. 中國中醫科學院，北京 100700)

功能性消化不良(functional dyspepsia，FD)屬于功能性胃腸病范疇，主要表現為上腹痛或灼燒，餐后早飽、腹脹等，且并無引起這些癥狀的具體疾病，消化系統也無任何器質性病變[1-2]。目前，FD的發病機制尚處于探索階段，主要認為可能與腦腸軸、腦腸肽、HP(Helicobacter Pylori，幽門螺桿菌)感染、胃腸動力障礙、內臟高敏感性、腸道菌群失調、心理及精神因素、輕度炎癥等相關[3]。有研究發現[4]，十二指腸的輕度炎癥能引起局部感覺、運動障礙，從而導致腹脹、腹痛。Toll樣受體(TLRs)和NF-κB (Nuclear factor κB，核轉錄因子κB)可激發細胞信號，啟動炎癥反應[5-6]。在哺乳動物細胞膜上發現了10余種TLRs模式識別受體,其中TLR4在炎癥組織中表達最多，如潰瘍性結腸炎。動物實驗研究發現[7]，當抑制NF-κB p65表達時，可顯著降低炎癥因子水平，因此NF-κB p65在炎癥反應中發揮重要作用。本實驗檢測十二指腸TLR4(Toll-like receptors 4,Toll樣受體4)、NF-κB p65表達情況及血清IL-6(Interleukin 6，白介素-6)、TNF-α(Tumor Necrosis Factor α，腫瘤壞死因子α)水平，探究電針治療FD的新靶點及FD的發病機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用SPF級雄性SD大鼠30只，體質量(200±20)g，購自三峽大學實驗動物中心，許可證號SCXK(鄂)2017-0012。經湖北中醫藥大學實驗動物福利委員會許可飼養于SPF動物房，室溫22 ℃～25 ℃，相對濕度50%～70%，每籠5只，適應性喂養1周后開始試驗。喂養期間自由飲水、攝食。本實驗已通過湖北中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查。

1.2 主要試劑與儀器

TLR4抗體(Santa Cruz公司，批號Sc-293072)，NF-κB p65抗體(武漢三鷹，批號10745-1-ap)。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)；兔多抗(杭州賢至，批號AB-P-R 001)；HRP標記羊抗小鼠二抗(武漢博士德，BA1051)；HRP標記羊抗兔二抗(武漢博士德，BA1054)；水合氯醛(上海國藥集團公司，批號40935760)。

華佗牌0.35×25 mm(1寸)無菌針灸針(蘇州醫療用品廠有限公司);HANS-200 A型韓式穴位神經刺激儀(南京濟生醫療科技有限公司); 垂直電泳槽(北京六一儀器廠，型號：DYCZ-24DN)；電轉儀(北京六一儀器廠，型號：DYCZ-40)；離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，型號：HI650)；酶標儀(Thermo，型號：mμLISKANMK3)；自制大鼠鼠衣及懸掛大鼠裝置。

1.3 實驗動物分組及造模

將30只SD大鼠按隨機數字表法分為空白對照組、模型組、電針組各10只。模型組及電針組大鼠參考多因素干預法[8]加以適當改良制備FD肝郁脾虛模型。冰生理鹽水灌胃：配制0.9% NaCl溶液，置于冰箱中冰凍至-4 ℃，每次灌胃2 mL，每日1次；夾尾法刺激：用長尾夾包裹紗布以免損傷大鼠尾部，夾在大鼠尾部后2/3處，以不破皮為度, 令其暴怒并激怒全籠大鼠，表現為大鼠均站立，雙上肢打斗，每天1次(刺激間隔不少于6 h)，每次30 min，隔日禁食，飲水正常。以上三法按順序同時實施，造模20 d。每日21時稱大鼠體質量并登記，記錄所有大鼠每日食物等質量。

造模成功標志：大鼠體質量進行性減輕；活躍程度從時常籠中自發打斗至喜成堆蜷縮，敲打籠子仍不動彈，抓捕反應遲鈍；情緒由稍有聲響就易怒煩躁轉變為持續噪音刺激或是喂食仍無特別反應，情緒異常低落；鼠毛從白凈順滑至凌亂、倒張、發黃，大鼠糞便從深棕色、干燥、質硬、無臭、長條圓柱狀進展成棕黃色、濕潤、質軟、微臭、短條圓柱狀，最后成為黃綠色稀便，可見未消化的顆粒飼料奇臭。經模型評價，模型組及電針組20只大鼠造模均成功，在造模期間空白組大鼠給予安靜環境隔離，不予任何處置。

1.4 電針刺激

造模結束后第2天開始對電針組進行電針干預。給電針組大鼠穿上定制的鼠衣后懸掛于自制懸掛架上。參照《實驗針灸學》[9]選取“足三里”穴，即大鼠的“后三里”穴。再選取“太沖”穴酒精局部消毒后，采用0.35×25 mm(1寸)針灸針分別直刺深度約12.5 mm(約0.5寸)、5 mm(約0.2寸)。將雙側“后三里”穴接韓氏穴位神經刺激儀連續波，頻率2 Hz，強度1 mA，雙側“太沖”穴靜留針，每次治療時間30 min，每日治療1次(9AM～11AM)，治療14 d。空白組和模型組在治療期間給予電針組同樣的穿鼠衣及懸吊，不予其他任何處置，在安靜環境中隔離。在電針組最后1次治療結束，將各組大鼠稱重并禁食24 h后取材。

1.5 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，酶聯免疫吸附劑檢測)測定血清IL-6、TNF-α水平

治療結束后各組大鼠均禁食24 h后取材，用20%烏拉坦4 mL/kg腹腔注射麻醉后,給予腹主動脈采血，3000 r/min離心15 min,取上清液后置于干凈EP管。根據酶聯免疫吸附試劑盒說明書，按步驟檢測大鼠血清IL-6、TNF-α水平，操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.6 WB(Western blot，免疫印跡法)檢測十二指腸TLR4、NF-κB p65蛋白表達

取少量十二指腸碎組織加入0.3 mL裂解液勻漿后裂解，隨后于4 ℃下12000 r/min離心5 min，取上清液，提取總蛋白之后用DG-3022 A酶標儀測定蛋白濃度。隨后將提取的蛋白上清與5ⅹ蛋白上樣緩沖液進行沸水浴中10 min，使蛋白變性。配置5%濃縮膠、12%分離膠后開始電泳、轉模、免疫印跡顯色等步驟檢測后得到灰度條帶，用Image J軟件對蛋白條帶灰度值進行測定。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠血清IL-6、TNF-α水平比較

表1示，與空白對照組比較, 模型組及電針組大鼠血清IL-6均升高,模型組TNF-α水平升高，差異有統計學意義 (P<0.05)，但電針組TNF-α水平較空白組比較差異無統計學意義(P>0.05)，與模型組比較, 電針組大鼠血清IL-6、TNF-α均下降，差異有統計學意義(P<0.05)，提示電針能明顯降低肝郁脾虛FD模型大鼠血清IL-6、TNF-α的含量。

表1 各組大鼠IL-6、TNF-α水平比較

2．2 各組大鼠十二指腸TLR4、NF-κB p65表達比較

圖1示，與空白對照組比較，模型組大鼠十二指腸TLR4、NF-κB p65表達顯著增多(P<0.05)。與模型組比較，電針組大鼠十二指腸TLR4、NF-κB p65表達明顯降低(P<0.05)。

注：與空白組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05圖1

3 討論

FD雖然并不是致命的急性疾病，但其極度影響患者的生活質量，加重社會醫療負擔。據調查[10]，在全世界范圍內，20%的人群受FD困擾。因此，FD的病因病機研究一直是熱點。羅馬Ⅳ標準提出，低度炎癥、腸道菌群改變等可能與FD發病有關[10]。研究表明，功能性胃腸病患者均存在低度黏膜炎癥和免疫細胞活化，且與腸黏膜屏障損傷及腸神經異常敏感有關[11-12]。

TLRs位于細胞膜上，是一種模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)。TLRs能激活免疫應答，是防御外來毒物的第一層屏障，也是目前應用于抗炎癥治療的重要靶點[13-14]。研究表明，TLRs可通過激活下游信號通路產生大量炎癥因子，誘導疾病的發生[15]。大鼠胃腸黏膜上存在TLR4，正常狀態下TLR4表達量極少，當機體處于炎癥狀態時，TLR4表達增多。研究發現，TLR4激活可使樹突狀細胞等免疫細胞相繼活化，分泌大量促炎細胞因子如IL-6、TNF-α等，導致組織炎癥損傷[16]。NF-κB是一種重要的參與炎癥介導的核轉錄因子，p65 是NF-κB的5個亞單位之一。在靜息狀態下與抑制性蛋白(Inhibitor kappaB, IκB)結合，存在于細胞質中；當受到內源性或外源性刺激，NF-κB中脫離IκB入核與DNA結合，參與相應蛋白合成，調控炎癥免疫反應。NF-κB的下游促炎因子如TNF-α和IL-6，可在其被激活后迅速增多并加劇炎癥反應[17]。因此，NF-κB p65可反映炎癥嚴重程度，也可用來評價療效[18]。

中醫并無FD命名，根據該病的相關癥狀，其屬于“痞滿”“胃脘痛”范疇。中醫療法治療FD療效顯著，已經越來越受廣大醫生及患者的認可，如電針、穴位敷貼、耳穴貼壓、拔罐等[19]。臨床研究表明[20]，電針治療FD患者后可顯著緩解上腹痛、早飽等不適。動物實驗中，電針可改善FD大鼠稀便、毛發干枯凌亂[21]、增強胃腸動力[22-23]、減輕局部炎癥及免疫反應[24]等，因此電針治療FD療效肯定。本實驗模型大鼠為肝郁脾虛證，選取太沖穴可疏理肝氣，調暢氣機；足三里穴可補中氣、調理氣機、幫助運化, 疏通胃腸，兩穴合用共奏補虛瀉實、疏肝健脾之功。實驗數據顯示，電針治療后大鼠十二指腸TLR4、NF-κB p65蛋白表達顯著降低，且IL-6、TNF-α也較模型組降低。提示電針減輕FD大鼠炎癥反應，可能通過降低TLR4、NF-κB p65表達實現。因此，本研究結果驗證了FD病因可能與消化道低度炎癥有關，而TLR4、NF-κB p65二者之間可能存在某種關系，減輕炎癥因子(IL-6, TNF-α)的合成，但二者之間的信號溝通關系需要進一步研究。