基于血清藥物化學與網絡藥理學探究麝香通心滴丸治療冠心病的機制

王 偉 劉星雨 尚云龍 姚建標 王建方 宋永標 王如偉?

（1.浙江中醫藥大學藥學院， 浙江 杭州310052； 2.浙江康恩貝制藥股份有限公司， 浙江 杭州310052；3.浙江省中藥制藥技術重點實驗室， 浙江 杭州310052； 4.內蒙古康恩貝藥業有限公司圣龍分公司，內蒙古 鄂爾多斯017400）

“血清藥物化學” 這一理論最先由德國科學家格哈德·多馬克所提出［1］，后來我國科學家王喜軍教授［2］提出符合中醫藥理論的中藥血清藥物化學。中藥成分較為復雜［3］，經口服給藥后，普遍認為發揮藥效的活性成分應該是被吸收入血的成分［4］。通過分析口服給藥后血中成分，可確定中藥在體內直接起作用藥效成分。網絡藥理學［4?7］通過生物學網絡中節點的連接和關系來分析藥物對疾病網絡的干預，從整體效應角度預測藥物靶點，是闡明中藥復方作用機制的重要手段之一。近年來文獻［8?12］報道的網絡藥理學研究大多數是以各數據庫中成分的口服生物利用度為篩選指標。然而多味中藥在組成復方后，其原本的一些成分在其它成分的協同作用下，會使其原本較低的生物利用度得到改善，并且更改相應的藥物劑型也會提高其生物利用度［13?14］。因此對于多成分的中藥復方制劑，僅靠數據庫中的口服生物利用度為篩選指標，會導致靶點預測不夠精確。麝香通心滴丸為內蒙古康恩貝藥業有限公司圣龍分公司已上市產品，收載于2015 年版《中國藥典》 一部，于2017 年1 月13 日被列入國家中藥保護品種，全方包括麝香、蟾酥、人參莖葉總皂苷、丹參、人工牛黃、熊膽粉、冰片，該品種屬于心腦血管領域用藥［15?17］。雖然臨床上治療冠心病療效顯著，但其藥效物質基礎并不明確。本文通過HPLC?Q?TOF／MS 對麝香通心滴丸進行血清藥物化學研究，并基于網絡藥理學對入血成分治療冠心病的作用機制進行研究，為深入闡明麝香通心滴丸作用機制提供一定的依據。

1 材料

1.1 儀器 1260 高效液相色譜儀、6530 Q?TOF／MS 四極桿飛行時間質譜儀（美國安捷倫公司）；高速冷凍離心機、渦旋振蕩器（美國賽默飛世爾科技公司）；Sartorius BS210S十萬分之一電子天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 試劑與藥物 麝香通心滴丸（內蒙古康恩貝有限公司圣龍分公 司，批 號180607）。蟾毒靈（批 號111981?201501，純度99.2%）、熊去氧膽酸（批號110755?201704，純度99.4%）、脂蟾毒配基（批號110718?201809，純度98%）購自中國食品藥品檢定研究院；遠華蟾毒精（批號PS010798，純度98%）、去乙酰華蟾毒精（批號PS010804，純度98%）購自成都普思生物科技股份有限公司；沙蟾毒精（批號5283，純度98%）、甘氨膽酸（批號6723，純度98%）購自上海詩丹德標準技術服務有限公司；牛磺膽酸（批號PST190801?061，純度98%）購自成都樂美天醫藥科技有限公司。乙腈（批號SHBK3440，色譜純）、甲醇（批號10958407824，色譜純）購自默克化工技術（上海）有限公司。

1.3 動物 5 只SPF 級健康雄性SD 大鼠，購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司，生產許可證號SCXK（滬）2013?0016，由浙江中醫藥大學動物實驗中心代為飼養，使用許可證號 SYXK（浙）2013?0184，條件為溫度（22±1）℃，相對濕度50%～60%，12 h 光照，通風頻率15～20 次／h。大鼠以標準飼料喂養，飲水自由，倫理審查決議編號ZSLL?2017?054。

2 方法

2.1 麝香通心滴丸入血成分分析

2.1.1 麝香通心滴丸混懸液制備 取適量麝香通心滴丸粉研磨成粉末，加入適量0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，調整質量濃度為0.4 g／mL，即得，搖勻備用。

2.1.2 動物給藥與血清樣品采集 SD 大鼠給藥前禁食12 h，自由飲水，以6.4 g／kg 劑量給藥。給藥前采集空白血樣，在給藥15、30、45、60 min 后眼眶取血各約0.5 mL，收集至EP 管中靜 置30 min，室溫下以3 000 r／min 離心10 min，取上層血清，備用。

2.1.3 血清樣本處理 分別精密吸取200 μL 空白血清和含藥血清（將“2.1.2” 項下4 個時間點含藥血清各吸取50 μL 混勻）于1.5 mL EP 管內，加入5 倍量甲醇渦旋5 min，離心（4 ℃、10 000 r／min）10 min，上清液于常溫下氮氣吹干，100 μL 甲醇復溶，渦旋5 min，離心（4 ℃、10 000 r／min）5 min，取上清液供MS 分析。

2.1.4 色譜條件 Hydro?RP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，4 μm）；流動相0.4% 甲酸乙腈（A）?0.2% 甲酸水（B），梯度洗脫（0～5 min，5% A；5～13 min，5～20% A；13～40 min，20～22% A；40～60 min，22～45% A；60～75 min，45～75 A%）；柱溫30 ℃；體積流量1.3 mL／min；進樣量10 μL。

2.1.5 質譜條件 離子源ESI，掃描方式ESI＋、ESI?模式；干燥氣體溫度320 ℃，體積流量10 L／min；鞘氣溫度350 ℃，體積流量12 L／min；碎裂能量175 V；毛細管電壓3 kV；正負離子采集范圍m／z50～1 500。

2.2 網絡藥理學研究

2.2.1 預測潛在靶點 將分析得到的麝香通心滴丸入血成分通過PubChem 數據庫得到其mol2 格式文件，并將其上傳至PharmMapper 服務器（限定靶蛋白為人類，其余為默認選項），采用“藥效團匹配方法” 得到虛擬篩選結果。將篩選出的分子?靶點匹配度（Fit Score）大于等于3 的藥物靶點作為靶蛋白，并通過UniProt 數據庫輸入篩選得到的蛋白靶點PDBID，經檢索和轉化操作得到的麝香通心滴丸入血成分的潛 在作用靶點。通 過 GeneCards 數據庫，以“coronary atherosclerotic heart disease” 為關鍵詞，檢索與冠心病相關的基因，并與上述成分靶點匹配進行分析，篩選與麝香通心滴丸入血成分相關的作用靶點。

2.2.2 蛋白相互作用網絡構建與分析 String 數據庫是一種包含已知和預測蛋白質與蛋白質相互作用的數據庫，將上述成分?疾病交集靶點導入String 數據庫，限定物種為人類（Homo sapiens），最低相互作用閥值設為高等置信度0.9 “highest confidence”，同時顯示設置隱藏游離點，然后下載PPI 圖形件并保存tsv 文件，最后使用R 語言對得到的PPI 進行核心基因的篩選，其余參數保持默認設置。

2.2.3 靶標GO 富集分析和KEGG 通路富集分析 本研究通過David 6.7 數據庫，對成分?疾病交集靶點蛋白進行GO富集分析、KEGG 通路富集分析，其中GO 富集分析包括生物過程（biological process）、分子功能（molecularfunction）和細胞組分（cellular component）3 個部分，Select Identifier設置為Official GeneSymbol，List Type 設置為Gene List，限定物種為人，并用FDR 錯誤控制法對P 值作檢驗校正，最終以“P＜0.05” 作為條件進行篩選，篩選出具有顯著差異的代謝通路。

2.2.4 入血成分與核心靶點的分子對接 對上述麝香通心滴丸的入血成分與核心靶基因進行分子對接，首先通過PubChem 數據庫得到各分子的化學結構式。在PDB 數據庫檢索靶基因蛋白構象，并根據以下條件篩選：通過X 晶體衍射法獲取的蛋白結構；蛋白的晶體解析度小于3 ?；分型明確的蛋白。然后，使用AutoTools 對蛋白進行加氫去除水分子預處理，AutoGrid 進行能量格點計算，Autodock Vina 進行小分子與蛋白對接，對每個對接進行結合能（af?finity）評分，PyMoL 作活性分子和蛋白的互相作用圖。

3 結果

3.1 麝香通心滴丸大鼠入血成分分析 健康大鼠灌胃給予麝香通心滴丸混懸液后，血清樣品的正負離子圖（BPC 模式）見圖1，與對照品離子圖比對后共鑒定出8 種入血成分，見表1。

表1 麝香通心滴丸入血成分

化合物1：正離子模式下，一級質譜分析其準分子離子為m／z417.227 1 ［M＋H］＋，保留時間為41.239 min，對其進行二級質譜分析，結果見圖2，其主要的碎片離子有m／z399.215 2 ［M?H2O＋H］＋、363.191 7 ［M?3H2O＋H］＋。將沙蟾毒精的標準品溶液進行HPLC?MS／MS 分析，所得的一級與二級質譜及保留時間與化合物1 相同，由此確認其為沙蟾毒精。

圖1 樣品血清離子圖

化合物2：負離子模式下，一級質譜分析其準分子離子為m／z514.283 3 ［M?H］-，保留時間為52.446 min，對其進行二級質譜分析，結果見圖3，其主要的碎片離子m／z496.271 6 為準分子離子失去1 分子H2O ［M?H2O?H］-。將牛磺膽酸的標準品溶液進行HPLC?MS／MS 分析，所得的一級與二級質譜及保留時間與化合物2 相同，由此確認其為牛磺膽酸。

圖2 沙蟾毒精質譜圖

圖3 牛磺膽酸質譜圖

化合物3：正離子模式下，一級質譜分析其準分子離子為m／z403.247 1 ［M＋H］＋，保留時間為55.824 min，對其進行二級質譜分析，結果見圖4，其主要的碎片離子有m／z367.226 4 ［M?2H2O＋H］＋、349.216 3 ［M?3H2O＋H］＋、253.193 9 ［M?C5H9O5＋H］＋、215.179 0 ［M?C8H11O5＋H］＋。將遠華蟾毒精的標準品溶液進行HPLC?MS／MS 分析，所得的一級與二級質譜及保留時間與化合物3 相同，由此確認其為遠華蟾毒精。

圖4 遠華蟾毒精質譜圖

化合物4：負離子模式下，一級質譜分析其準分子離子為m／z464.302 5 ［M?H］，保留時間為56.952 min，對其進行二級質譜分析，結果見圖5，其主要的碎片離子m／z402.299 6 為準分子離子失去1 分子水和1 分子羧基［M?H2O?COOH?H］-。將甘氨膽酸的標準品溶液進行HPLC?MS／MS 分析，所得的一級與二級質譜及保留時間與化合物4 相同，由此確認其為甘氨膽酸。

圖5 甘氨膽酸質譜圖

化合物5：正離子模式下，一級質譜分析其準分子離子為m／z401.231 3 ［M＋H］＋，保留時間為60.756 min，對其進行二級質譜分析，結果見圖6，其主要的碎片離子為準分子離子m／z365.200 9 失去2 分子H2O ［M?H2O＋H］＋。將去乙酰華蟾毒精的標準品溶液進行HPLC?MS／MS 分析，所得的一級與二級質譜及保留時間與化合物5 相同，由此確認其為去乙酰華蟾毒精。

圖6 去乙酰華蟾毒精質譜圖

化合物6：正離子模式下，一級質譜分析其準分子離子為m／z387.251 6 ［M＋H］＋，保留時間為62.649 min，對其進行二級質譜分析，結果見圖7，其主要的碎片離子有m／z369.242 1 ［M?H2O ＋H］＋、351.231 3 ［M?2H2O ＋H］＋、255.209 6 ［M?C5H7O4］＋。將蟾毒靈的標準品溶液進行HPLC?MS／MS 分析，所得的一級與二級質譜及保留時間與化合物6 相同，由此確認其為蟾毒靈。

圖7 蟾毒靈質譜圖

化合物7：負離子模式下，一級質譜分析其準分子離子為m／z437.290 6 ［M＋COOH］-，保留時間為65.025 min，對其進行二級質譜分析，結果見圖8，其主要的碎片離子m／z391.284 3 為準分子離子失去1 分子甲酸［M?HCOOH］-。將熊去氧膽酸的標準品溶液進行HPLC?MS／MS 分析，所得的一級與二級質譜及保留時間與化合物7 相同，由此確認其為熊去氧膽酸。

圖8 熊去氧膽酸質譜圖

化合物8：在正離子模式下，一級質譜分析其準分子離子為m／z385.237 2 ［M＋H］＋，保留時間為68.868 min，對其進行二級質譜分析，結果見圖9，其主要的碎片離子有m／z367.227 2 ［M?H2O＋H］＋、349.214 9 ［M?2H2O＋H］＋、253.194 8 ［M?C5H7O4］＋。將脂蟾毒配基的標準品溶液進行HPLC?MS／MS 分析，所得的一級與二級質譜及保留時間與化合物8 相同，由此確認其為脂蟾毒配基。

3.2 麝香通心滴丸入血成分網絡藥理學研究

3.2.1 作用靶點預測 將麝香通心滴丸8 個入血成分上傳至PharmMapper 數據庫后得到的所有靶點，刪除重復并整合得到作用靶點249 個。通過與GeneCards 數據庫中的1 778個與冠心病相關基因進行匹配，并通過R 軟件繪制韋恩圖，篩選出134 個成分?疾病交集靶點，見表2、圖10。再通過Cytoscape 3.7.1 軟件將8 個入血成分與134 個成分?疾病交集靶點相連，繪制出麝香通心滴丸的藥物?靶點相互作用的網絡圖，見圖11。

3.2.2 蛋白相互作用網絡構建與分析 將韋恩圖得到的134 個交集基因輸入String 數據庫中進行分析得到PPI 圖，見圖12，其中包括134 個節點，347 條邊，平均節點度值為5.18，PPI 富集P 值少于1.0×1016，其中節點表示蛋白，每條邊則表示蛋白與蛋白之間的相互作用關系，線條越多表示關聯度越大。將String 中下載的tsv 文件用R 語言進行處理（以各蛋白連接的節點個數為指標，列舉節點數排名前30 個的蛋白），得到PPI 中的核心基因絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、酪氨酸激酶（SRC）、磷脂酰肌醇3 激酶（PIK3R1）等核心基因，見圖13。

圖9 脂蟾毒配基質譜圖

表2 成分?疾病交集靶點

圖10 藥物?疾病交集靶標韋恩圖

3.2.3 靶標GO 富集分析及通路富集分析結果 利用David 6.7 平臺對134 個藥物?疾病交集靶點進行GO 富集分析及通路富集分析。GO 富集分析包括分子功能分析、細胞組分分析、生物學過程分析，以?lgP值進行排名并列出排名前15 的途徑，見圖14。在分子功能層面主要涉及類固醇激素受體活性、配體依賴性核受體活性等方面；在細胞組分層面主要涉及細胞外基質、細胞質、細胞質囊泡等方面；生物學過程層面主要涉及有機物質的反應、內源性刺激的反應、激素刺激的反應、調節細胞增殖等方面。對富集得到的通路結果，以?lgP值及各通路連接的基因數從大到小進行排名，見圖15。通過查閱文獻，該8 個入血成分可能通過ErbB signaling pathway、VEGF signaling pathway、PPAR signaling pathway 等信號通路治療冠心病。

圖11 藥物?靶點相互作用網絡圖

圖12 麝香通心滴丸入血成分與疾病共有靶點PPI 網絡圖

3.2.4 分子對接 講上述8 個入血成分與上述互作關系排名前10 的核心靶點進行分子對接，結果見表3，結合能（affinity）越小則對接結果越好，affinity＜-7 表示具有較好的結合活性，可見該8 個入血成分與大多數核心靶點對接結果基本較好。其中，去乙酰華蟾毒精與MAPK1 結合活性最高，其分子對接細節模擬見圖16，可知小分子結合在蛋白的活性口袋，并且有和活性口袋有較好的匹配。

4 討論

本文前期按照一定梯度濃度探索麝香通心滴丸最佳給藥劑量［18］，分別以0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 g／kg 的給藥劑量對SD 大鼠進行灌胃，并對各劑量組下的大鼠分別于給藥15、30、45、60、75、90、105、120 min 后進行眼眶取血并分析血樣。結果，大鼠在6.4、12.8 g／kg 劑量下各時間段含藥血清的離子流圖更豐富，并且基本一致，但12.8 g／kg 較為濃稠，給灌胃帶來不便。最終，以6.4 g／kg為大鼠給藥劑量。

圖13 節點數目前30 的靶點

本研究參考文獻［19?20］，分別采用甲醇和乙腈沉淀血清中的蛋白，發現甲醇沉淀處理得到的血中移行成分數目較多，內源性雜志干擾較少，因此提取溶劑選用甲醇。前期考察了15、30、45、60、75、90、105、120 min 共8個采血點，對血清樣本質譜數據進行分析，發現不同的入血成分會出現在不同采血時間點樣本中，然而在60 min 后其入血成分的提取離子流響應較低，因此選擇混合前4 個取血點的血樣進行分析。

大多數中藥口服給藥后，移行入血的成分才可能發揮藥效，通過分析口服給藥后血清中的入血成分來確定中藥于體內直接作用物質，已成為確定中藥藥效物質基礎的有效途徑。本文基于HPLC?Q?TOF／MS 對麝香通心滴丸進行血清藥物化學研究，通過與對照品比對鑒定出8 個成分，文獻［21?22］報道，沙蟾毒精、遠華蟾毒精、脂蟾毒配基、蟾毒靈等均具有一定強心的作用。

圖14 入血成分與疾病交集靶點GO 富集

圖15 KEGG 通路富集

表3 有效成分與核心靶點的分子對接

圖16 去乙酰華蟾毒精與MAPK1 的分子對接細節圖

Pharm Mapper 是預測化合物生物活性，并建立相應的公共網絡服務器［23］。本研究通過該服務器，采用反向藥效團匹配方法得到虛擬篩選結果，并與GeneCards 數據庫中治療冠心病相關的靶點相結合，得到134 個作用靶點，通過David 數據庫對其進行KEGG 通路分析，發現這8 種入血成分有較多基因靶點有富集在與冠心病相關的通路上。通過Autodock Vina［24］對上述入血成分與核心靶基因進行分子對接，結果顯示入血成分與核心靶點結合性較好。

冠心病是冠狀動脈發生動脈粥樣硬化，導致血管腔狹窄甚至阻塞，造成心肌缺血、缺氧而導致的心臟病。細胞凋亡是冠心病病理過程的重要因素，抗凋亡基因Bcl?2 和促凋亡基因Bax 共同參與［25］，ErbB signaling pathway 通路與細胞凋亡密切相關，其中Bcl?2 家族在內源性凋亡過程中起重要調控作用［26］。研究表明心肌細胞心肌缺血損傷后可通過活化ErbB signaling pathway 通路，誘導內源性Nrg?1 下調促凋亡分子Bax 表達，減輕細胞由于缺氧復氧而造成氧化應激的損傷。Lin 等［27］通過Na2S2O4誘導H9c2 細胞氧化應激后，在細胞培養液中加入一定濃度的麝香通心滴丸后，結果表明麝香通心滴丸顯著提高了Na2S2O4處理誘導的H9c2 心肌細胞的活力并抑制了其異常形態學變化麝香通心滴丸預處理可減輕Na2S2O4引起的缺氧損傷，下調H9c2 細胞凋亡前Bax 的表達，并上調抗凋亡Bcl?2 的表達。

麝香通心滴丸具有調節過PPAR 信號通路的潛在作用。PPAR 信號通路對冠心病的發展和糖代謝起著重要的調節作用。PPAR 主要有PPARα、PPARβ 和PPARγ 三種表型。研究表明，PPARα 和PPARγ 的激活能通過抑制血管內皮炎癥反應，抑制細胞增殖和遷移，抑制單核細胞轉化成泡沫細胞，減少血管細胞黏附分子?1、ICAM1 表達等多個方面，發揮治療冠心病的作用［28］。PPAR?γ 對糖代謝的調節主要是增加外周組織對胰島素的敏感性，從而改善胰島素抵抗［29］。本研究發現PPAR 信號通路上有麝香通心滴丸與冠心病的 共同靶 點PPARA、APOA2、PPARD、RXRB、RXRA、PPARG、FABP3、MMP1、FABP5、NR1H3，因此，推測麝香通心滴丸可能通過調節PPAR 信號通路，改善胰島素抵抗來治療冠心病。

血管內皮生長因子（VEGF）是調節生理或病理的血管新生及增加血管通透性的一個重要細胞因子，它與內皮細胞上的受體結合后會提高微血管的通透性，導致大量的炎性細胞滲入肺間質并產生膠原酶降解內皮下基底膜及細胞外基質，進而促進內皮細胞增生遷移，從而形成新生血管［30］。VEGFR2 是VEGF 的主要功能受體，其與VEGF 相結合主要介導血管的生成，VEGF／VEGFR2 信號通路是VEGF 信號通路中的主要信號通路，可促進血管內皮細胞的增殖、遷移、分化，同時抑制其調亡。VEGF 是血管生成過程中具有關鍵性的生長因子，可以增加血管密度，促進缺氧區甚至無血管區域內皮細胞增殖，誘導缺血組織內的血管新生，是目前臨床上已知的最強的內皮細胞有絲分裂原，可有效促進心肌重塑［31］，本研究發現VEGF signaling pathway 通路上有麝香通心滴丸與冠心病的共同靶點PIK3CG、CDC42、MAPK1、MAP2K1、MAPK14、PLA2G2A、RAF1、SRC、PIK3R1、KDR、AKT2，因此推測麝香通心滴丸可能通過調節VEGF signaling pathway 通路來治療冠心病。

綜上所述，本研究基于血清藥物化學與網絡藥理學，在體內化學成分分析辨識的基礎上通過關聯網絡構建及分析，初步闡釋了麝香通心滴丸治療冠心病作用機制，可為中藥藥效物質基礎分析及其相關作用機制探究提供一定依據。