降糖藥物相關基因芯片檢測技術的建立和應用

盧雪玲 再努爾·買合木提 王寧

(新疆醫科大學 1第二附屬醫院，新疆 烏魯木齊 830000；2第一附屬醫院)

糖尿病(DM)是一種以高血糖為特征的內分泌代謝紊亂綜合征〔1〕，肥胖、家族遺傳、運動缺乏等是引起DM的主要危險因素〔2〕。DM主要分為4種類型，其中90%以上為2型糖尿病(T2DM)〔3〕。雖然普遍認為T2DM基本致病機制是胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷，但其發病機制目前仍不清楚，但研究表明是環境和遺傳因素共同作用的結果〔4，5〕。目前T2DM的治療包括飲食、運動調節和口服降血糖藥物。但口服降血糖藥由于遺傳因素在個體間藥效動力學和不良反應等存在差異〔6〕。故從基因水平上研究降糖藥物相關基因多態性，對指導個體差異化治療、避免不良反應和提高藥物安全性有重要作用〔7〕。從化學結構分類看降糖藥物分為5類〔8〕。磺脲類口服降血糖藥物通過與受體結合，引起K+-ATP通道關閉，β細胞膜去極化，鈣離子濃度升高，進而使胰島素分泌增加，相關的基因有 CYP2C19、KCNJ11、ABCC8、TCF7L2 和 IRS(胰島素受體底物)1等〔9～11〕。雙胍類(二甲雙胍、苯乙雙胍)口服降血糖藥物能促進脂肪組織對葡萄糖的攝取，拮抗抗胰島素因子，相關基因有有機陽離子轉運體基因(OCT)1和OCT2，二者分別在肝臟和腎臟中表達〔12〕。胰島素增敏劑(噻唑烷二酮類)可促進脂肪酸氧化和糖的吸收，增加骨骼肌、肝臟、脂肪組織對胰島素的敏感性，相關基因有PPARγ和脂連素基因(APM)1〔13〕。促胰島素分泌藥(非磺脲類)降糖藥物包括瑞格列奈(諾和龍)和那格列奈，作用機制為通過刺激胰腺釋放胰島素而使血糖水平快速降低，但增加了低血糖的風險，相關基因有有機陰離子轉運多肽(OATP1)〔14〕。基因芯片是基于分子生物學中核酸互補雜交原理的一門新技術，具有高通量、大規模、平行性等特點，對于不同個體藥物篩選有非常重要作用〔15〕。基于糖尿病患者個體間遺傳突變位點多，異質性強及人群患病率及攜帶致病基因的比例高等特點，建立快捷、高通量的基因診斷方法對差異化治療和安全用藥有重要意義。本研究以P450酶基因和OCTs相關基因為候選基因，通過Fluidigm公司生產的帶有12個SNP位點的芯片檢測門診收集的34例糖尿病患者。

1 材料和方法

1.1一般資料 34例患者均來自新疆醫科大學第二附屬醫院內分泌科門診，均為維吾爾族，男13例，女21例，于2016年1～12月收集，年齡為26～80〔平均(52.7±6.72)〕歲，病程(6.24±3.31)年。在進行體重指數(BMI)、血糖、總膽固醇(TC)和三酰甘油(TG)、血漿胰島素和C肽等生理指標測定確診為DM后。經知情同意，對所有患者進行病史調查(包括家族史、DM史及降糖藥物使用情況等)，同時進一步明確DM類型。

1.2基因芯片技術建立相關材料 稀釋液、晶芯BioMark HD微陣列芯片掃描儀、Juno分析系統、質控探針和 DNA 芯片、雜交盒(SNPtypeTMGenotyping Kit)及雜交試劑均由Fluidigm公司提供。PCR熒光染料和質控探針分別購自QIAGEN和Life Technologies。

1.3樣本采集和處理 在征得研究對象知情同意后，用EDTA抗凝采血管抽取外周靜脈血5 ml。所有血樣用小量基因組DNA抽提試劑盒(英捷領先生物)提取DNA，利用核酸測定儀檢測DNA的純度和濃度，于-20℃保存備用。

1.4引物及探針設計 探針和引物采用Fluidigm SNP Type Assay Design網站設計合成，每個位點都有3個對應的引物：STA、LSP和ASP1/ASP2，見表1。

1.5基因芯片構建及檢測 通過文獻篩查，我們發現12個位于P450酶基因和OCTs相關基因上的SNP位點，這些位點均已證明與遺傳性糖尿病有相關性。以提取的DNA為模板，采用多重等位基因特異性PCR (ARMS-PCR)同時結合芯片技術。選取帶有Tag標簽序列的基因位點特異性引物擴增SNP位點所在的片段并進行熒光標記。

1.5.1PCR 多重PCR體系：將2組引物分成A和B兩個反應體系，各加入DNA 0.5 μg，等位基因特異性引物(ASP1和ASP2)各100 μmol/L，位點特異性引物(LSP)100 μmol/L，補充DNA擴增混合液至終體積為40 μl。PCR反應程序：預變性，96℃ 1 min；擴增，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，32個循環；延伸：70℃ 45 s，60℃ 10 min。該過程終降溫速率為0.4℃/s，升溫速率為0.2℃/s。

1.5.2雜交與清洗 將標記的DNA加熱至95℃變性5 min后，立即冰浴3 min。從不同擴增體系中(同一模板)各取2.5 μl PCR產物加到10 μl雜交緩沖液，將混合液加到芯片的微陣列區域，50℃預熱水浴中雜交1 h。雜交結束后，在42℃洗滌液中洗滌2 min，之后在0.2×SSC溶液中室溫洗5 min，甩干后掃描。

表1 12個SNP位點的引物和探針

1.5.3結果判定 利用Fluidigm SNP Genotyping Analysis軟件(Fluidigm公司，美國)，針對降糖藥物相關基因常見的12個突變位點(表2)進行基因分型分析。

表2 12個降糖藥物相關基因位點信息

2 結 果

2.1降糖藥物相關基因芯片檢測結果 基因芯片檢測34例糖尿病患者，1例發生rs10509681，rs11572080和rs662301突變，3例發生rs12208357突變，4例發生rs1057910突變，5例發生rs4149056突變，6例發生rs11920090突變，8例發生rs72552763堿基缺失，12例發生rs316019和rs683369突變，發生rs2016520突變的患者最多，達15例。

2.2突變位點的遺傳結構分析 12個位點中，有1個是堿基缺失，芯片檢測結果表明有1個在所有患者中未檢測到突變。對剩余10個位點進行遺傳結構分析(表3)，結果顯示rs2016520，rs316019和rs683369位點在群體中雜合度較大，表明這些位點在群體內變異程度大。rs2016520和rs316019位點處于中度多態(0.25

2.3突變位點Hardy-Weinberg平衡檢驗 納入研究的12個位點，其中rs2016520，rs12208357，rs316019和rs683369 4個位點Hardy-Weinberg平衡檢驗有統計學意義(P<0.05)。其他位點可能在進化過程中受選擇壓的影響。見表4。

表3 突變位點的遺傳結構分析

表4 位點Hardy-Weinberg平衡檢驗

3 討 論

基因學可明確遺傳因素對藥物效應的影響，從而指導臨床合理用藥具有重要意義〔16，17〕。細胞色素P450 酶基因對藥物的氧化還原和水解起催化作用，能影響藥物的代謝速率，是重要的藥物代謝酶〔18〕。相關研究表明，血糖異常表達與P450 酶活性密切相關，P450基因敲除的模式動物脂肪組織對葡萄糖的攝取能力增強，胰島素對肝糖原分解的抑制能力提高〔19〕。研究中發現22例有P450基因位點的突變，表明這些患者產生DM的原因可能是P450 酶活性被誘導，酶總含量升高，進而所產生的大量活性氧(ROS)，最終造成糖代謝紊亂和血糖升高。CYP450 酶系的表達受遺傳、年齡、性別和環境等影響，患病狀態下CYP450 酶系各亞型會產生誘導和抑制，進而導致藥物受到影響，產生嚴重的毒性反應〔20〕。

許多藥物發揮作用需要基因的作用，其療效可能因為這些基因的突變而改變。由于二甲雙胍在體內不與蛋白結合，不被代謝，而OCT家族基因可促進二甲雙胍的轉運從而使其廣泛分布在包括腸、肝臟和腎臟在內的多個身體組織中〔21〕。如OCT1有助于將二甲雙胍轉運入組織液，在腎小管重吸收中扮演重要角色，OCT2可促進二甲雙胍從循環系統到腎小管上皮細胞中的吸收，OCT3可影響二甲雙胍在肝臟中的吸收〔22～24〕。OCTs基因突變位點與降糖效果顯著相關。其中OCT1基因屬于溶質轉運家族，負責把二甲雙胍轉運進入肝細胞進行代謝，是目前OCTs家族基因中研究最多的。如攜帶OCT1 rs622342 C位點的患者服用二甲雙胍后，與AA基因型患者相比糖化血紅蛋白(HbA1c)水平的降低較緩慢〔25〕。OCT l基因胞內降解片段中的突變可影響其與許多藥物的綁定。研究納入的OCT1 rs2282143-2位點，在全球很多人群中都被檢測到，該突變可導致轉運體活性顯著降低，但是不會徹底失活〔26〕。隨著轉錄組測序，全基因組關聯分析等技術的進步，降糖藥物相關基因的發現和克隆也取得了重大進展。但這些基因及不同位點的突變在不同種族甚至相同種族不同人群中都有很強的特異性。基因芯片技術在近幾年的基因診斷中運用愈來愈廣泛，采用核酸分子雜交，將大量特定的基因片段或寡核苷酸片段作為探針，有序且高密度地排列固定于載體上，產生二維 DNA 探針陣列，從而得到基因突變的信息〔27〕。基因芯片技術可以同時、快速、檢測多個突變位點，自動化程度高。本研究成功構建了P450酶基因和OCTs基因相關突變位點的芯片。