腎茶黃酮預(yù)防急性腎缺血模型大鼠再灌注損傷作用及其機制

郭銀雪 葛平玉 詹繼紅

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1腎內(nèi)科，貴州 貴陽 550001；2泌尿外科)

急性腎損傷是多種因素引發(fā)的腎功能急劇快速下降綜合征，而腎臟缺血則是急性腎損傷發(fā)生的重要原因之一〔1,2〕。對急性腎缺血再灌注損傷進行防治可能有助于減少急性腎缺血再灌注引發(fā)的急性腎衰竭及其相關(guān)不良預(yù)后。腎茶已被證實在急慢性腎炎、泌尿系統(tǒng)結(jié)石疾病、感染疾病等泌尿系統(tǒng)疾病治療中可取得良好效果〔3,4〕。因此，推測腎茶提取物腎茶黃酮應(yīng)用于急性腎缺血再灌注損傷可能有效。因此，本研究采用腎茶提取物腎茶黃酮進行急性腎缺血大鼠模型再灌注損傷的治療，觀察了其對腎功能、氧化應(yīng)激等的影響及其可能機制。

1 資料與方法

1.1實驗動物 以48只SPF級SD大鼠為研究對象，均購自貴陽醫(yī)學(xué)院提供實驗動物中心，購買后均單籠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，飼養(yǎng)條件為溫度維持在22～25℃，相對濕度維持在50%～60%，正常進行光照，期間注意保持空氣流通，大鼠均自由飲水和攝食。飼養(yǎng)的籠子進行編號并在籠子上標注說明，根據(jù)隨機數(shù)表，將飼養(yǎng)的大鼠分為研究組(n=24)和對照組(n=24)。研究符合倫理學(xué)標準并經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會審核批準。兩組基線資料比較無明顯差異(P>0.05)，有可比性，見表1。

表1 兩組基線資料比較

1.2儀器和試劑 標準大鼠顆粒飼料由貴陽醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，艾本德5424離心機購于德國艾本德公司，恒溫箱購于南京泰斯特試驗設(shè)備有限公司，超低溫冰箱購于青島海爾特種電器有限公司，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒購于南京建成生物工程研究所，德國歐寶xl-600 全自動生化分析儀購于北京瑞博泰克生物科技有限公司，Bax單克隆抗體、Bcl-2單克隆抗體購于艾美捷科技有限公司，Bax 二抗、Bcl-2二抗均購于美國CST中國分公司，顯微鏡購于上海光學(xué)儀器廠，微量移液器購于德國艾本德公司，血肌酐檢測試劑盒購于北京博邁斯科技發(fā)展有限公司，人腎損傷分子(KIM)-1檢測試劑盒購于上海研卉生物科技有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1腎缺血再灌注模型建立 兩組適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后均制造為腎缺血再灌注模型，具體操作如下：術(shù)前1 d大鼠均禁食1個晚上，對手術(shù)操作臺及器械進行嚴格消毒，采用50 mg/kg的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，確認麻醉適宜后綁起大鼠四肢并固定于操作臺。于大鼠腹部正中處行一長約3 cm的縱向切口，顯露右腎及腎蒂，常規(guī)行右腎切除，并無損傷左腎動脈夾閉1 h后松開血管。確認腎臟灌注良好后縫合關(guān)閉切口。

1.3.2干預(yù)方法 研究組在再灌注24 h開始腹腔注射0.1 g/ml腎茶黃酮配比液2 ml，每12 h 1次，2次/d。對照組同期腹腔注射等量0.9%生理鹽水。腎茶黃酮配比液的制作方法如下：取腎茶藥材以粉碎機粉碎后過10目篩備用，取5 g粉末，以乙醇為提取溶劑進行回流提取，提取結(jié)束后將提取液蒸干并稱重，采用NaNO2-Al(NO3)3比色法測得總黃酮含量〔5〕，并以0.9%生理鹽水配置成0.1 g/ml腎茶黃酮配比液。

1.3.3指標檢測 再灌注24 h、48 h、72 h、96 h分別隨機處死大鼠6只。取各組大鼠腎組織常規(guī)制成石蠟切片，檢測時將石蠟切片常規(guī)進行脫蠟水化處理，一抗為兔抗大鼠Bax或Bcl-2多克隆抗體(1∶50稀釋)，二抗為生物素化羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(1∶100稀釋)，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，隨意取5個高倍視野進行染色觀察，以超過20%細胞出現(xiàn)棕黃色或棕褐色染色為陽性,Bax和Bcl-2均染色定位于胞質(zhì)。心臟采血4 ml常規(guī)進行離心和取血清冷藏待測處理，血清丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸比色分析法，SOD活力測定采用黃嘌呤氧化酶法，血清肌酐(SCr)、KIM-1等腎功能指標水平等各血清指標的檢測均采用全自動生化分析儀，具體檢測操作嚴格按照儀器及試劑盒的說明進行。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進行χ2檢驗、兩獨立樣本均數(shù)t檢驗、Spearman相關(guān)分析、Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組腎功能變化比較 兩組灌注24 h組腎功能比較無明顯差異(P>0.05)。與對照組比較，研究組灌注48 h、72 h、96 h的血清SCr、KIM-1等腎功能指標水平顯著降低(P<0.05)，見表2。

2.2兩組腎組織Bax、Bcl-2蛋白陽性表達率變化比較 兩組灌注24 h組腎組織Bax、Bcl-2蛋白陽性表達率比較無明顯差異(P>0.05)。與對照組比較，研究組灌注48 h、72 h、96 h的腎組織Bax蛋白陽性表達率顯著升高，而同期腎組織Bcl-2蛋白陽性表達率顯著降低(P<0.05)，見表2。

2.3兩組血清氧化應(yīng)激指標水平變化比較 兩組灌注24 h組血清氧化應(yīng)激指標水平比較無明顯差異(P>0.05)。與對照組比較，研究組灌注48 h、72 h、96 h的血清SOD活力水平顯著升高而同期血清MDA水平顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 兩組不同時間點腎功能、腎組織Bax、Bcl-2蛋白陽性表達率、血清氧化應(yīng)激指標水平比較

2.4研究組血清SCr、KIM-1水平與Bax、Bcl-2蛋白陽性表達率的關(guān)系 研究組血清SCr、KIM-1水平與Bax蛋白陽性表達率呈負相關(guān)(r=-0.792，-0.831，P<0.05)，與Bcl-2蛋白陽性表達率則呈正相關(guān)(r=0.805，0.879，P<0.05)。

2.5研究組血清SCr、KIM-1水平與血清SOD活力、MDA的關(guān)系 研究組血清SCr、KIM-1水平與血清SOD活力水平呈負相關(guān)(r=-0.811，-0.842，均P<0.05)，與血清MDA水平則呈正相關(guān)(r=0.863，0.795，均P<0.05)。

3 討 論

腎臟是高灌注器官，其血流量達到心臟的1/4，對缺血和缺血再灌注損傷十分敏感〔6,7〕。腎缺血再灌注損傷是急性腎損傷的常見病因，急性腎缺血再灌注損傷可導(dǎo)致腎臟血流量的明顯減少、腎小球濾過功能降低、腎小管功能堵塞等，這些因素均可導(dǎo)致腎臟缺血缺氧及其相關(guān)病理改變的發(fā)生〔8～10〕。本研究結(jié)果顯示，急性腎缺血再灌注損傷發(fā)生后腎功能損傷明顯，若無及時有效干預(yù)可能進一步引發(fā)腎衰竭而危及生命安全。因此，對急性腎缺血再灌注損傷進行及時有效的防治十分重要。

研究表明腎茶在急慢性腎臟疾病中均可取得較好的效果，可提高免疫力，改善腎功能等，且其低毒安全，臨床推廣具有良好基礎(chǔ)〔11,12〕。本研究證實了腎茶在腎臟疾病中的應(yīng)用效果，這與張少貴等〔13〕的研究結(jié)果一致。Bax、Bcl-2均與腎組織細胞凋亡損傷密切相關(guān)〔14〕。因此，腎茶黃酮可能通過抑制急性腎缺血再灌注損傷大鼠腎組織細胞凋亡而達到改善其腎功能的目的。SOD活力和MDA均為反映氧化應(yīng)激狀態(tài)指標〔15,16〕。因此，腎茶黃酮可能通過降低急性腎缺血再灌注損傷大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)而達到其保護腎功能的目的。然而基于本研究樣本量偏小、觀察時間較短等，腎茶黃酮對急性腎缺血再灌注損傷大鼠腎功能的影響及其可能機制尚需進一步大樣本量的研究證實。

本研究提示腎功能狀況可能與腎組織細胞凋亡損傷及氧化應(yīng)激損傷狀況密切相關(guān)，急性腎缺血再灌注損傷腎功能受腎組織細胞凋亡損傷及氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響，從而進一步證實了抑制腎組織細胞凋亡損傷及改善氧化應(yīng)激狀態(tài)干預(yù)可改善性腎缺血再灌注損傷腎功能的可能性。

綜上所述，腎茶黃酮預(yù)防急性腎缺血模型大鼠再灌注損傷效果良好，其機制是可能通過調(diào)控Bax和Bcl-2表達及降低氧化應(yīng)激反應(yīng)達到預(yù)防急性腎缺血再灌注損傷作用，腎茶黃酮可能作為急性腎損傷防治藥物。