PET水解酶的研究進展

石利霞 高松楓 朱蕾蕾

（中國科學院天津工業生物技術研究所，天津 300308）

聚對苯二甲酸乙二醇酯（Polyethylene terephthalate，PET）是以石油為原料的一種常見塑料，由對苯二甲酸（Terephthalic acid，TPA）和乙二醇（Ethylene glycol，EG）通過酯鍵聚合而成［1］。PET廣泛應用于包裝、建筑、電氣等行業，如飲料瓶、薄膜和工程塑料［2］。PET在被廣泛應用的同時，由于其廢棄物難以自然降解而造成了嚴重的環境污染。目前，PET廢棄物的處理方法主要有垃圾填埋法、熱處理法、化學回收法，這3種處理方式產生的廢氣廢水均會對環境造成二次污染且帶來巨大的能源消耗［3］。近年來，生物回收塑料廢棄物因其作用條件比較溫和環保、安全性較高而備受關注，將有望發展成為塑料降解的方法之一。

目前已從微生物中分離出多種PET水解酶，包 括 角 質 酶［4-12］、脂 肪 酶［13-22］、PETase［23］等。PET水解酶可在較為溫和的條件下將PET水解為對苯二甲酸單羥乙酯（Mono（2-hydroxyethyl）terephthalic acid，MHET）、對苯二甲酸雙羥乙酯（Bis（2-hydroxyethyl）terephthalic acid，BHET）、乙二醇（Ethylene glycol，EG）和對苯二甲酸（Terephthalic acid，TPA）等組分（圖1），而得到的單體可進一步循環利用，更加綠色環保。因此，使用酶法降解PET具有不可替代的優勢。其中，脂肪酶對PET的水解活性最低，這可能是由于其催化中心被“蓋子”結構覆蓋，從而阻礙了酶與底物的有效催化，一般需要在反應體系中添加表面活性劑（如洗滌劑或增塑劑）進行界面活化以增強活性［15］。角質酶是目前研究最廣泛的PET水解酶，已解析獲得若干來源于細菌和真菌的角質酶的晶體結構（表1），其含有較寬的底物結合口袋且沒有“蓋子”結構，容許剛性長鏈聚合底物PET進入酶的活性中心，所以對PET的水解活性較高。角質酶一般在高溫（50-70℃）條件下才能發揮降解作用（表1）。目前已發現幾種角質酶可以顯著降解結晶度較低的PET，如LCC［5］、HiC［6］等。將角質酶、脂肪酶用于PET水解是老酶新用，而PETase是2016年Yoshida等［23］從一種能“吃”PET塑料的細菌Ideonella sakaiensis中分離出的一種新型PET水解酶。它能夠在30℃條件下高效特異性水解PET，但其熱穩定性較差，與角質酶在高溫條件下才能發揮降解作用形成了鮮明的對比。其次，Yoshida等還發現Ideonella sakaiensis中存在一種類似阿魏酸酯酶的MHET水解酶MHETase，可將PET主要中間產物MHET特異性水解生成TPA和EG（圖1），對PET的完全降解也很重要。

PET水解酶在PET生物降解中顯示出巨大的潛力，但PET水解酶在催化效率、熱穩定性等方面仍存在諸多不足，目前無法很好地滿足工業應用需求。隨著蛋白質晶體結構、催化機制等研究的深入，利用（半）理性設計對PET水解酶進行分子改造的研究備受關注。本文綜述了不同PET水解酶的結構、降解機理，重點介紹了角質酶和PETase的分子改造進展，旨在為改造PET水解酶以實現其工業化應用提供一定的參考依據。

1 PET水解酶

1.1 角質酶

角質酶是存在于大多數植物病原菌和腐生植物中的胞外絲氨酸酯酶，可以水解水溶性酯、乳化的三酰甘油及合成聚酯，如聚ε-己內酯（Polycaprolactone，PCL）和聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）等［24］。表1列出了目前報道的可水解PET的角質酶類型及降解能力。

1.1.1 角質酶的結構和催化機制 角質酶屬于絲氨酸水解酶家族，具有α/β-水解酶結構。角質酶的活性位點處有氧陰離子穴，用于識別、結合底物；其催化三聯體（Ser-His-Asp）一般位于由疏水氨基酸包圍的表面溝槽中，有利于容納底物PET［9］。

來源于Thermobifida fuscaKW3的TfCut2的 晶體結構表明（圖2），殘基Y60和M131可以形成氧陰離子空穴，它們的主鏈氮原子與底物PET的羰基氧原子相互作用，從而使可裂解酯鍵靠近催化三聯體中的活性絲氨酸。此外，I178、W155和F209與PET鏈的苯環之間具有疏水相互作用，這些殘基與PET的相互作用均有利于酶對底物的識別［12］。

圖1 PET水解酶降解PET過程

表1 可水解PET的角質酶類型及降解能力

圖2 TfCut2的結構（PDB：4CG1）［12］

1.1.2 角質酶的分子改造進展

1.1.2.1 擴大酶活性位點空間及增加疏水性以提高角質酶活力 酶與底物的識別及結合是酶解過程中的重要環節，這要求酶的活性位點處有足夠的空間容納聚酯底物，因而對酶的活性口袋適當擴大可提高酶解效率［25-29］。同時增加活性位點處氨基酸的疏水性，也可促進酶分子與疏水底物的結合［30-31］。

基于上述理論，Silva等［25］采用定點突變的方法將來源于Thermobifida fusca的Tfu_0883進行分子改造，得到的突變體I218A和Q132A/T101A對PET纖維的降解活性均有提高。Araujo等［26］對來源于F. solani pisi的FsC的活性位點殘基進行突變，將該處的亮氨酸替換為空間位阻較小的丙氨酸，擴大了底物的結合口袋，得到的突變體L182A和L81A對PET纖維的水解活性分別提高了4倍和5倍。此外，Kawabata等［30］基于Cut190晶體結構進行半理性設計，將該酶的活性口袋擴大，以形成額外的空間更好地容納底物，得到的突變體Q138A的降解性能明顯提高。

1.1.2.2 增加二硫鍵以提高角質酶熱穩定性 二硫鍵的存在有利于蛋白質的穩定性，該特征已成功應用于改造提高酶的熱穩定性［31-33］。Then等［31］研究發現，當TfCut2的金屬離子結合位點結合Ca2+時，會抑制催化三聯體發揮作用，他們用二硫鍵替換該酶的金屬離子結合位點，不僅提高了該酶的熱穩定性，也消除了水解過程中該酶對Ca2+的依賴。最近，Tournier等［34］基于LCC的晶體結構進行理性設計，添加二硫鍵來提高LCC的熱穩定性，得到的突變體D238C/S283C的Tm與野生型相比提高了9.8℃，活性僅下降28%。其同時對底物結合附近的熱點氨基酸進行定點突變，在突變體D238C/S283C的基礎上進行組合，最后得到組合突變體F243I/D238C/S283C/Y127G（ICCG），Tm與WT-LCC相 比 提 高 了9.3℃，活性基本完全恢復。在72℃條件下反應9.3 h后，對切碎的PET塑料瓶（PcW-PET）的水解率高達90%，是目前為止效率最高的PET水解酶，且得到的單體可用于再生PET，有助于實現PET廢棄物的循環利用。

1.1.2.3 減少產物抑制 PET經過酶解后，產生的中間產物（BHET和MHET）可競爭性的結合到酶的底物結合位點，從而抑制PET的進一步降解［35］。Wei等［36］對TfCut2的氨基酸殘基進行突變，得到的突變體G62A的降解效率提高了2.7倍，分析表明，在TfCut2中，59位的Gly的主鏈氮原子可與MHET的羰基氧相互作用，而60位的Gly突變為Ala后，由于Ala側鏈引起的位阻，G62A突變體無法通過G59與MHET相互作用，從而導致該酶對MHET的結合常數降低了5.5倍。

采用雙酶體系也有利于PET的酶解，雙酶體系一般包括聚酯降解酶和清除中間產物的酶［35］。Barth等［37］采用固定化雙酶體系（TfCa-TfCut2和 TfCa-LCC）實現PET的高效降解，其中TfCa水解中間產物BHET和MHET，與單酶處理相比，雙酶的協同作用使水解產物總量分別增加91%和104%。

1.1.2.4 增加角質酶與底物有效接觸面積 聚酯降解酶與疏水結合域的融合有助于加快聚合物的水解作用［38］，可能是以下兩種原因：（1）酶表面的疏水性增加，與疏水聚合物之間的吸附性增強，使得聚合物界面上的酶量增加［39］；（2）有些結合模塊會破壞聚合物的結構，從而使得目標化學鍵更容易進入酶的活性位點區域［40］。Ribitsch等［41］將來源于Thermomyces cellullosylitica的Thc_Cut1與疏水性模塊CBM和PBM進行融合，得到的融合酶（Thc_Cut1+CBM）和（Thc_Cut1+PBM）對PET的吸附性增強，水解產物（MHET和TPA）的產量與Thc_Cut1相比明顯增加。Ribitsch等［42］還將Thc_Cut1與疏水蛋白HFB4和HFB7分別進行融合，得到的融合蛋白對PET的水解作用提高了約15倍。

1.2 PETase

與角質酶、脂肪酶相比，來源于Ideonella sakaiensis的PETase可以在30-40℃更加特異性高效降解PET［23］。

1.2.1 PETase的結構和催化機制 目前PETase的晶體結構已被中國、美國、韓國及德國等國家的研究團隊以不同的分辨率解析。PETase采用典型的α/β水解酶折疊方式，含有由9個β-鏈組成的中心：β-折疊，其被7個α-螺旋夾在中間［43］。PETase具有催化三聯體（S160-H237-D206）和氧陰離子穴（Y87、M161）［44-45］。PETase含有兩個二硫鍵，二硫鍵2（DS2）在所有同源酶中都是嚴格保守的，特異性二硫鍵1（DS1）位于活性位點附近（圖3-A）［44-45］。Fecker等［46］通過分子動力學模擬證明，PETase的活性位點在室溫下具有更高的柔韌性，這種柔韌性由其活性位點中獨特的二硫鍵（DS1）控制，將其除去會導致催化三聯體不穩定并降低活性。因此，DS1在PETase中起關鍵作用。

Joo等［43］使 用MHET四 聚 體（MHET4）和PETase進行分子對接計算，估算出其底物結合裂隙為40?的細長溝槽，分為兩個亞位點：亞位點I和II，分別結合1個和3個MHET部分。亞位點I中，MHET4的第一個MHET置于Y87和W185的兩個芳香族殘基之間，形成π-π相互作用。亞位點II由殘 基T88、A89、W159、I232、N233、S236、S238、N241、N244、S245、N246和R280組成，亞位點II根據第2、3和4個MHET的位置進一步分為IIa、IIb、和IIc。亞位點II和MHET4的后3個MHET主要是通過疏水相互作用介導的（圖3-B）。

根據PETase的晶體結構，與不同配體的分子對接模型，定點突變實驗及已熟悉的α/β水解酶家族的水解機理，推測PETase的催化機制［43-44，47-49］如下：當PET通過疏水相互作用與PETase結合時，PETase表面上形成淺裂縫，殘基（His和Asp）形成激活親核試劑（Ser）的電荷中繼網絡。位于第一苯環的羰基被引導至底物結合裂縫的中心，催化三聯體進行親核攻擊，形成第一四面體中間體，氧陰離子空穴使酯鍵極化并使反應中間體穩定。隨后，由水分子將該第一四面體中間體轉化為酰基-酶中間體，并進行第二次親核攻擊以裂解酯鍵。在酯鍵斷裂后，剩余的苯甲酸基團形成較寬平面，由于W185構象的可變性，其易于與W185側鏈面對面堆疊。因此，產物旋轉并被拉開，最終從活動中心釋放（圖3-C）。

近期，Wei等［50］通過Solid-state NMR實驗分析發現，無定形PET高分子鏈中乙二醇（EG）單元的OC-CO扭轉角Ψ的trans/gauche比率明顯低于2-HE（MHET）4中的t/g比率；且通過（MAS）NMR方法研究了無定形PET中的局域和大規模協同主鏈運動，表明無定形PET在30℃從gauche構象到trans構象的轉變受到了很大的限制。因此，其認為Joo等［43］使用柔性低聚合底物的構象擬合來解釋PETase對PET的降解機理可能不合理，促進底物結合的關鍵因素不是PET鏈構象的相互轉換，而是苯亞基與周圍疏水殘基之間的弱相互作用。Joo等（Seo）［51］做出回復基本同意以上觀點。因此若能解析PETase和底物PET或較長寡聚物的共結晶，則更有意義。

圖3 PETase的結構、底物結合位點和催化機制示意圖［43-44，47-49］

PETase對PET的水解活性高于其他PET水解酶，可能是由于以下獨特的結構特征：（1）PETase含有一對W159-S238殘基，可形成足夠的空間來容納底物；（2）PETase連接環中的3個額外的殘基S245、N246和Q247提供了足夠的空間來容納PET；（3）PETase在活性位點附近具有一個額外的二硫鍵，這對其熱穩定性和活性至關重要［52］；（4）PETase的W185存在多種構象，容許PET大分子進入酶的活性中心［27，44］。

1.2.2 PETase的分子改造進展

1.2.2.1 基于理性設計改變底物結合口袋 影響PET降解效率的主要因素在于酶與底物的有效吸附［53］。Joo等［43］通過分子對接發現，R280位于IIc的末端，似乎阻礙了底物的延伸，將其突變為丙氨酸，突變體R280A對PET的降解活性提高了約33%。Austin等［54］發現PETase比同源角質酶具有更開放的活性位點裂隙，通過將兩個活性位點殘基W159和S238突變為角質酶中保守的氨基酸，使結合裂縫變窄，所得突變體S238F/W159H降解PET的性能得到提高。Ma等［55］對底物結合附近的熱點氨基酸進行定點突變，同時，使用無細胞蛋白表達系統進行高通量表達和篩選，成功篩選出3株突變體：R90A，L117F和I208F，酶活性與野生型相比分別提高了約1.6、2.1和2.5倍。Liu等［56］根據PETase的結構進行定點突變，篩選出5株酶活性提高的突變體：Y87A、W159A、W159H、A209I和S214H，產物TPA的產量最高可達野生型的3倍。

Liu等［57］發現PETase對于萘酯幾乎沒有降解作用，其基于PETase結構信息對催化中心周圍的關鍵殘基進行了突變，以改變這些殘基的疏水性，減輕空間位阻效應，得到的突變體S93M、W159F和N241F都能水解萘酯。

1.2.2.2 基于理性設計和固定化技術增強PETase熱穩定性 一般來講，聚合物在接近或高于玻璃化溫度（Tg）的條件下，其非結晶區域會變得更加靈活，更容易接受酶的攻擊，從而加快降解速率［58-59］。酶促反應在水溶液中進行，PET的Tg值降低至60-65℃［60］。而PETase在30-40℃下降解PET，極大的限制了催化效率。

Son等［61］為了提高PETase的熱穩定性，開發了一種合理的蛋白質工程策略。綜合考慮蛋白質熱穩定性與活性的關系，其集中在遠離活性位點的結構區域進行研究，發現在PETase中，由于β6鏈的異常構型，中心β片層被打斷，與總體b因子（16.1）相比，β6-β7連接環顯示出更高的b因子（22.2），隨后將PETase與熱穩定性較高的TfCut2的相應區域進行比較發現，由于氫鍵的存在，β6-β7連接環在TfCut2中形成了相當穩定的結構。因此，其擬通過在PETase中引入氫鍵增加β6-β7連接環的穩定性。最后得到具有穩定的β6-β7連接環（S121E/D186H）和底物結合亞位點IIc得到擴展（R280A）的三突變體：S121E/D186H/R280A，與野生型相比，該突變體的Tm值提高了8.81℃，PET的降解活性在40℃提高了約14倍［61］。

Liu等［57］采用硫酸銨沉淀法和戊二醛交聯法固定化PETase，提高了PETase的熱穩定性，最適溫度從25-35℃延長至25-45℃，酶活力在65℃時仍保持較高活性。

1.2.2.3 增加PETase與底物有效接觸面積 若使用合適的分子介導酶與PET之間相互作用，可以增加酶與PET膜的接觸面積，酶的降解活性得到改善［42］。

王澤方等［62-63］通過研究表明疏水蛋白的自組裝功能可以控制PETase在PET表面的有效吸附，同時利用大腸桿菌和畢赤酵母表面共展示HFBIPETase融合酶，可極大提高酶的催化效率。由于PETase表面帶正電荷（pI=9.4），Furukawa等［64］嘗試將PET膜與不同的陰離子烷基表面活性劑預孵育，將PET表面轉化為帶負電荷，然后再進行酶促水解，結果表明，PET膜經表面活性劑預處理后，PETase降解活性在30℃提高了約120倍。

1.2.2.4 PETase分泌表達 PET作為一種高分子聚合物，無法進入細胞，其降解需將PETase分泌至胞外。盡管Ideonella sakaiensis可以分泌PETase降解PET，但面對各種環境條件，其分泌量可能較低。因此，從常應用于工業的宿主中獲得PETase的分泌表達非常重要。

Huang等［65］采用B.subtilis168表達系統，測試3個Sec信號肽和2個Tat信號肽及其天然信號肽SPPETase用于介導PETase的分泌量，結果表明，通過PETase天然信號肽SPPETase介導得到最高分泌量的有活性的PETase。Seo等［66］通過將來自大腸桿菌的Sec依賴性信號肽融合到PETase中，建立了5個PETase分泌表達系統，使用表達量最高的pET22b-SPLamB：IsPETase分泌系統成功表達出對PET膜有活性的細胞外酶PETase。Moog等［67］使用海洋光合單細胞真核生物Phaeodactylum tricornutum作為PETase的宿主，成功得到分泌型融合蛋白AP_SPPETaseR280A-FLAG，其在不同條件下對不同PET底物（商業瓶PET、PETG和PET粉碎物）顯示出不同的降解能力，有助于PET微塑料污染海水的生物修復。Chen等［68］將酵母菌P. pastorisGS115作為宿主來表達PETase，同時從宿主中選擇3種內源性GPImodified細 胞 壁 蛋 白：GCW21、GCW51、GCW61作為錨定蛋白來展示PETase，最后得到有催化活性的融合蛋白：pPIC9-PETase-GCW21/51/61，實現PETase的酵母細胞表面展示降解高結晶度的PET，且與純酶相比，轉化率提高了約36倍。

此外，定向進化技術也是蛋白質分子改造的一個重要策略［69］。其利用易錯PCR等技術建立突變體文庫，然后采取合適的篩選體系在特定條件下篩選得到目標突變體［70］。本實驗室最近通過對PETase分泌表達系統的信號肽進行定向進化，篩選得到的信號肽突變體使得PETase的胞外分泌量提高了約3倍［71］。

1.3 脂肪酶

脂肪酶又稱甘油酯水解酶，屬于羧基酯水解酶類［72］。一些脂肪酶不能水解PET膜，但對PET纖維和寡聚物有活性［73-74］（表2）。

脂肪酶同樣采用α/β水解酶折疊方式，其還具有由α-螺旋的額外肽段構成的“蓋子”結構域，可蓋住活性口袋以保護催化三聯體［75］（圖4為來源于T.lanuginosus的脂肪酶TLL的結構［76］）?！吧w子”的存在使得剛性聚合物較難進入底物結合位點，所以脂肪酶對PET的水解活性較低，其對PET纖維的主要作用是使其表面親水化，削弱纖維強度，但無法顯著降解PET的結構模塊，因此也有研究者將脂肪酶歸類為PET表面修飾酶［77］。

表2 脂肪酶類型及對PET的水解能力

圖4 TLL的結構（PDB：1DT3）［76］

1.4 MHETase

MHETase同樣是從Ideonella sakaiensis201-F6中分離得到的一種水解酶，它能與PETase協同作用，將PETase中間產物MHET降解為TPA和EG，對PET的完全降解也很重要［23］。通過多重序列比對，初步認定MHETase屬于鞣酸酶家族［78］。

最 近，Palm等［78］首 次 解 析 出MHETase的晶 體 結 構，MHETase存 在α/β水 解 酶 結 構 域（MHETaseHyd）和 蓋 子 結 構 域（MHETaseLid），MHETaseLid為α螺旋折疊結構（圖5-A）。

他們解析了MHETase-MHETA（（2-羥乙基）對苯二甲酰胺）的復合物結構［78］。MHETA的整個苯環部分與MHETaseLid結構域的殘基F415，L254和W397緊密結合，游離羧酸鹽的兩個氧與MHETaseLid的R411結合（圖5-B）。由此說明，盡管MHETase存在典型的催化三聯體和氧陰離子孔，但其底物特異性幾乎完全由MHETaseLid賦予。

他們推斷MHETase的誘導機制如下：在無配體的結構中，F415指向遠離活性位點的位置，底物結合位點屬于打開狀態；當底物MHETA進入底物結合位點后，會觸發F415側鏈繞 χ1旋轉近180°，從而封閉活性位點并鞏固相互作用。所以，不同于PETase，MHETase與底物的結合非常緊密，導致其特異性地水解MHET，而對BHET和PET并無水解活性，表現出高度的底物特異性［78］。

此 外，Palm等［78］通 過 定 點 突 變 來 改 變MHETase的底物特異性，使其能夠降解BHET。因此通過MHET的結構表征，將來有可能合理地設計出更有效更實用的MHETase突變體，使其不僅可以降解MHET，還可降解PET的其他中間產物。

2 展望

目前，研究者對PET水解酶已有一定的研究基礎，根據已有PET水解酶的晶體結構及催化機理進行（半）理性設計有希望獲得降解性能大幅度提高的突變體。同時，應結合定向進化采用高效的篩選方法實現PET水解酶的高通量篩選，推動PET水解酶的高效開發。另外，在已有條件下可以將目前已發現的多種PET水解酶協同發揮作用，如在利用PETase降解PET過程中，可以加入MHETase以去除中間產物MHET，而反應條件如何控制，則需要我們后續的深入研究；也應該繼續篩選挖掘可將PET塑料作為唯一碳源的微生物，如篩選在海洋環境中可降解微塑料的菌株，并挖掘關鍵酶基因等。此外，要實現PET水解酶的工業化應用，還需考慮PET自身的物理性質，如結晶度、玻璃化轉變溫度（Tg）、熔點、可用表面積等。PET較高的玻璃化轉變溫度要求水解酶具有較高的熱穩定性從而可在高于PET的Tg條件下更加高效降解PET，而PET水解酶的熱穩定性還有待大幅度提高。另外，為擴大酶的可接觸表面積，PET材料的機械預處理也是必要的。因此，若能將PET的材料性能研究與水解酶研究有機統一起來，做到物理學、化學、生物學的綜合應用，將有望實現PET的完全降解及循環利用?？傊阜ń到釶ET具有巨大的應用前景，需要大力開發，以期在不久的將來作為綠色環保工具應用于塑料的降解。

圖5 MHETase的結構和底物結合位點［78］