銀紋夜蛾性信息素類似物的合成與活性研究

馬好運 ，李 慧 ，王留洋 ，翁愛珍 ，趙紅盈 ，梅向東 *，折冬梅 ，寧 君

（1.中國農業科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；2.黑龍江省森林保護研究所，哈爾濱 150040）

銀紋夜蛾［Argyrogramma agnata(Staudinger)］隸屬鱗翅目，夜蛾科，是豆類和十字花科蔬菜重要的害蟲之一[1-2]，廣泛分布于韓國、日本、中國等亞太國家[3-4]，在中國主要分布于黃河、淮河、長江流域等大豆、花生、蔬菜生產區，具有雜食性和遷飛性，一年發生2～7代，世代交替嚴重[5]。傳統多采用化學農藥進行防治，同時也利用天敵昆蟲、蘇云金桿菌SD-5、銀紋夜蛾核多角體病毒等措施進行防治[6-7]。近年來研究表明昆蟲信息素在害蟲監測與防控中同樣發揮著重要作用[8]，可以為銀紋夜蛾的科學防控開辟一條新的途徑。

嗅覺是許多動物感知外界的一種重要方式，通過調節昆蟲嗅覺來改變昆蟲的行為，可以作為一種工具有效地用于害蟲管理[9]。昆蟲信息素作為昆蟲嗅覺的重要組成部分，已廣泛地應用于害蟲的預測預報、干擾交配、大量誘捕等方面。遺憾的是，目前利用信息素對銀紋夜蛾進行監測與防控的研究相對較少。自1990年日本科學家Sugie等[10]提出豆銀紋夜蛾性信息素組分為順-7-十二碳烯乙酸酯（Z7-12∶Ac）和順-9-十二碳烯乙酸酯（Z9-12∶Ac）以來，幾乎沒有銀紋夜蛾信息素的相關報道。我國對銀紋夜蛾的研究也主要集中在化學防治與核多角體病毒及蛋白受體等方面。中國是日本的鄰國，但地理隔離常常導致昆蟲性信息素存在多樣性，即不同地域的同一種昆蟲性信息素在組分和比例方面可能存在一定的差異[11]。因此，明確銀紋夜蛾中國品系性信息素的組分，開展相應的性信息素及其類似物的研究，對于中國銀紋夜蛾的綠色防控具有重要意義。

先前的研究顯示天然的信息素存在田間易降解、合成成本高等問題，昆蟲性信息素類似物作為昆蟲性信息素的衍生與發展，不僅可以有效地彌補天然性信息素的不足，同時還能夠有效地調節昆蟲的化學通訊，繼而影響昆蟲的行為[12]。自1967年第一個關于舞毒蛾的性信息素拮抗劑報道以來[13]，有關昆蟲性信息類似物的研究逐漸增多，近年來已成為研究熱點[14-16]。昆蟲性信息素類似物主要來源于對天然性信息素的修飾，其修飾主要包括碳鏈修飾和極性基團修飾。極性基團修飾包括甲酸酯、丙酸酯等普通酯基取代和氟代乙酸酯、氯代乙酸酯等鹵化酯基取代2種情形：①在普通酯基取代的研究中，Camps等[17]發現松舟異蛾信息素的甲酸酯和丙酸酯類似物與天然信息素以一定比例混合后，對天然信息素有較好的增效活性；然而Schwarz等[18]發現歐洲玉米螟信息素甲酸酯取代類似物對其天然信息素有較強的拮抗活性；Roelofs等[19]發現紅縱卷葉蛾信息素的甲酸酯和丙酸酯取代類似物對其天然信息素也具有一定的抑制活性。②在鹵化酯基取代的研究中，徐妍等[20]發現梨小食心蟲性信息素組分Z8-12∶Ac的氯甲酸酯類似物能夠顯著降低成蟲近距離的交配率；Siderhurst等[21]發現果蠅Drosophilid的信息素組分覆盆子酮的三氟取代類似物，其表現出與天然性信息素相當的引誘活性；張開心[16]在小菜蛾性信息素鹵代類似物的設計合成中發現有3種鹵代類似物能夠顯著干擾小菜蛾的化學通訊。在此基礎上筆者對銀紋夜蛾性信息素組分順-9-十二碳烯乙酸酯（Z9-12∶Ac）的極性基團進行了不同的修飾，其中包括對其極性端進行普通酯基取代以及鹵化酯基取代修飾，設計合成出了4種結構新穎的銀紋夜蛾性信息素類似物，并對所合成的化合物進行結構表征。室內昆蟲電生理（EAG）顯示，銀紋夜蛾雄蟲對4種化合物均表現出較好的響應，這一結果使銀紋夜蛾利用昆蟲信息素類似物進行監測與防控成為可能，為銀紋夜蛾的綠色防控開辟了新途徑。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：Bruker-500MHz NMR核磁共振儀、Bruker solariX質譜儀，布魯克（北京）科技有限限公司；觸角電位儀，荷蘭欣泰公司。

試劑：順-9-十二碳烯-1-醇（純度95%），上海麗晶生化科技有限公司；丙酰氯、異丁酰氯、2-氯乙酰氯、3-氯丙酰氯（AR級），上海源葉生物科技有限公司；二氯甲烷（DCM）、三乙胺（TEA）（AR級），上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

供試蟲源：銀紋夜蛾成蟲采集于北京市延慶區舊縣鎮有機農業示范園。實驗試蟲為實驗室飼養羽化后成蟲；飼養條件為：溫度25±3℃，相對濕度70±10%，光周期16 h∶8 h（L∶D）。將羽化的成蟲單獨置于拇指管中，并用10%的蜂蜜水飼養，以備使用。

1.2 合成

4種銀紋夜蛾性信息素類似物的合成路線見圖1。

圖1 4種銀紋夜蛾性信息素類似物的合成路線

1.3 合成步驟

以順-9-十二碳烯-1-醇丙酸酯（W1）的合成為例：向裝有磁子的圓底燒瓶中依次加入1.0 g順-9-十二碳烯-1-醇、25 mL重蒸DCM、0.82 g三乙胺，冰鹽浴下攪拌5 min。將0.75 g丙酰氯溶于5 mL重蒸DCM中，用膠頭滴管將丙酰氯溶液逐滴加入上述溶液中。低溫反應30 min后撤去冰鹽浴，TLC監測反應，待反應結束后，用去離子水淬滅反應。用有機層經飽和食鹽水洗滌、無水硫酸鈉干燥后，減壓下濃縮，得到淡黃色狀粗產物。粗產物經硅膠柱分離（乙酸乙酯∶石油醚=1∶30），得到目標產物順-9-十二碳烯-1-醇丙酸酯（W1），產率為78%。

采用與目標化合物W1相類似的合成方法合成類似物W2～W4。

W1～W4的物理性狀、產率、核磁共振數據及質譜數據如下：

順-9-十二碳烯-1-醇丙酸酯（W1）為淺黃色油狀物，產率78%。

1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ：5.81-5.72（m，2H）、4.51（t，J=13.6 Hz，2H）、2.77-2.73（m，2H）、2.49-2.43（m，4H）、2.06-1.56（m，12H）、1.40（t，J=15.1 Hz，3H）、0.52（t，J=22.0 Hz，3H）；13C-NMR （500 MHz，CDCl3）δ：173.61、130.57、128.34、63.46、28.71、28.37、28.21、28.15、27.83、26.62、26.05、24.89、19.49、13.37、8.16；HR-MS（ESI）：m/zCalcd for C15H29O2［M＋H］＋，240.2101；found 240.2105。

順-9-十二碳烯-1-醇異丁酸脂（W2）為淺黃色油狀物，產率43%。

1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ：5.64-5.61（m，2H）、4.38（t，J=15.7 Hz，2H）、2.78-2.72（m，2H）、2.34-2.31（m，H）、2.30-2.28（m，2H）、1.88-1.62（m，12H）、1.41（t，J=18.4 Hz，6H）、0.52（t，J=19.8Hz，3H）；13C-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：170.12、128.31、128.25、61.23、31.25、29.82、29.80 （2C）、29.42、28.96、27.82、25.34、20.35、18.72（2C）、7.86；HR-MS（ESI）：m/zCalcd for C16H31O2［M＋H］＋，254.4108；found 254.4114。

順-9-十二碳烯-2-氯乙酸酯（W3）為淡黃色油狀物，產率65%。

1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ：5.32-5.28（m，2H）、4.40（s，2H）、4.21（t，J=17.8 Hz，2H）、2.22-2.08（m，4H）、1.68-1.24（m，12H）、0.58（t，J=15.4Hz，3H）；13C-NMR（500MHz，CDCl3）δ：163.12、131.15、130.55、63.21、39.84、28.42、28.13（2C）、28.06、27.98、27.35、25.65、19.38、10.25；HR-MS（ESI）：m/zCalcd for C14H26ClO2［M＋H］＋，260.8012；found 260.0816。

順-9-十二碳烯-3-氯丙酸酯（W4）為淡黃色油狀物，產率58%。1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ：5.45-5.41（m，2H）、4.20（t，J=13.6 Hz，2H）、3.96（t，J=14.3 Hz，2H）、2.49（t，J=16.4 Hz，2H）、2.18-19.78（m，4H）、1.58-1.25（m，12H）、0.64（t，J=21.3 Hz，3H）；13C-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：170.32、132.31、132.25、62.81、38.72、38.02、29.32、29.31（2C）、29.25、28.75、27.67、27.53、20.02、12.13；HR-MS（ESI）：m/zCalcd for C15H28ClO2［M＋H］＋，274.8302；found 274.8308。

1.4 室內生物活性測試

昆蟲觸角電生理實驗（EAG）的具體操作如下：

分別準確稱量0.10 g所合成的4種銀紋夜蛾性信息素類似物，將其各自溶于1 mL的色譜純正己烷溶液中，采用梯度稀釋配置為0.01、0.1、1、10、100、1 000 μg/μL的待測溶液。將不同質量濃度的待測溶液均勻地滴加在對折的濾紙條上（長6 cm，寬1 cm），將上述濾紙條放入巴斯德管內（長22.5 cm，內徑6 mm），以添加有分析純正己烷的濾紙條作為對照，實驗藥劑現配現用，以保證實驗結果的準確性。

挑選健康羽化2～3 d的銀紋夜蛾雄性成蟲用于實驗，實驗前黑暗處理2 h，實驗時用鑷子在顯微鏡下完整取下雄蟲的觸角，為保證電路的暢通，用刀片切除觸角的基部與末梢。將切好的觸角搭在玻璃電極的兩端，組成閉合回路，玻璃電極用0.1 mol/L氯化鉀溶液填充。為保證實驗的準確性，每頭雄蟲用一根觸角，每個處理重復3次。實驗結果用SPSS-24數據分析軟件進行分析，差異性顯著分析利用單因素方差分析（One-Way ANOVA）（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 合成及表征

在銀紋夜蛾性信息素類似物W1～W4的合成中，為保證原料能夠反應完全，醇與酰氯最佳加料比例為1.0∶1.2～1.5[22]。為避免酰氯與水接觸而溶解，反應溶劑二氯甲烷需經干燥處理[23]。在醇與酰氯接觸的瞬間會因反應體系溫度升高導致副產物增多，可將反應體系置于冰鹽浴中，以保持反應體系始終處于低溫狀態[24]。由于異丁基相比于丙基、3-氯-丙基相比2-氯-乙基的空間位阻較大，因此類似物W2、W4的產率分別低于W1和W3。同時在分離純化類似物W2時，由于副產物較多，需經多次純化，因此W2的產率較低。

采用核磁共振儀對合成得到的銀紋夜蛾類似物W1～W4進行分析，所得化合物與預期產物結構一致。以W1為例，在1H NMR中，目標化合物由于羰基的存在，與羰基相連的兩個碳上的氫的δ值向低場移動，其中與氧原子相連的碳原子上的氫化學位移值為4.51～4.48，表現為t峰，與羰基直接相連碳上的氫δ值為2.77～2.73，表現為m峰。由于共軛雙鍵的存在，順式雙鍵上的兩個氫的化學位移值向低場移動，δ值為5.81～5.72，表現為多峰。末端兩個甲基峰受相鄰碳上氫原子的影響，表現為三重峰，δ值分別為1.40～1.37、0.52～0.48。其余碳上的氫的化學位移主要集中于2.06～1.56，呈現出多重峰。

2.2 EAG活性

4種銀紋夜蛾信息素的類似物昆蟲觸角電生理試驗，結果如表1。銀紋夜蛾雄蟲對合成的4種結構新穎的類似物均有響應，并呈現出劑量-效應關系。類似物W1與W4在較低濃度時響應值出現負值，即響應值小于對照正己烷的，這可能是由于昆蟲觸角初次接受外界刺激時，反應靈敏度較高，隨著刺激次數的不斷增加，昆蟲觸角性信息素結合蛋白的電位變化反應處于疲憊狀態，只有接受足夠高濃度的刺激時，才能打破這種因疲憊而產生的誤差。當刺激質量濃度增加到10 μg/μL時，銀紋夜蛾對不同類似物的響應值隨刺激濃度升高而增加，直到達到飽和狀態[25]（圖2）。當質量濃度增加到1 000 μg/μL時，4種類似物的響應值也到達了最大值，其中類似物W2的響應值最大，達到了1.40±0.33 mV。銀紋夜蛾雄蟲對4種類似物質量濃度為10～100 μg/μL時，反應最為靈敏，因此，推測這4種類似物在田間最佳使用質量濃度應定位于10～100 μg/μL。此電生理實驗結果對其他行為實驗，以及田間試驗在最佳使用劑量、配比等方面的篩選具有一定的指導作用。

表1 銀紋夜蛾性信息素類似物直接刺激EAG活性

3 結論與討論

本文對銀紋夜蛾性信息素組分進行不同類型的修飾，設計合成了4種結構新穎的銀紋夜蛾性信息素類似物W1～W4。受空間位阻和鹵原子電負性的影響，類似物W2、W4的產率分別低于與其結構相似的W1和W3。合成反應時加入過量的酰氯和適當的縛酸劑，能夠保證反應充分進行。為避免因反應接觸瞬間反應體系溫度升高而導致副產物增多，將反應體系置于冰鹽浴中。室內電生理實驗結果表明，銀紋夜蛾對4種類似物均有一定的響應值，并呈現出劑量-效應關系。但電生理實驗只是研究昆蟲對嗅覺化學感受行為的一部分，并不能完全模擬昆蟲在自然條件下對不同氣味的反應強度，本文所合成的銀紋夜蛾性信息素類似物是否具有較好的田間生物活性，需展開進一步的研究與驗證。同時，昆蟲性信息素類似物的合成有效地彌補了天然信息素在田間易降解、持效期短等缺點，為銀紋夜蛾的綠色防控提供了新思路。