敲除OIP5-AS1基因通過miR-7-5p/PARP1軸增強非小細胞肺癌細胞的化學敏感性

靳彩玲，趙樹鵬，姬穎華，王犖楠，楊 軍，張清琴，牛紅蕊

肺癌包括小細胞肺癌和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，其中NSCLC是肺癌最常見的類型，占所有肺癌的80%～85%[1]。NSCLC治療主要通過手術、化療和放療，約75%的NSCLC患者發現時已處于中晚期，5年生存率很低。OIP5-AS1屬于腫瘤相關長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA, lncRNA)，在惡性腫瘤的演變中參與復雜的細胞機制[2]。OIP5-AS1已被證實是多種惡性腫瘤發生的重要調控因子[3]。然而，OIP5-AS1與miR-7-5p在肺癌中的相互作用尚未被提及和研究。因此，本實驗探討OIP5-AS1與miR-7-5p相互作用對NSCLC細胞化學敏感性的作用及分子機制，旨在為NSCLC的發病機制和治療策略提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料正常肺細胞系BEAS-2B、肺癌細胞系A549和順鉑耐藥肺癌細胞A549/DDP購自美國ATCC公司；Lipofectamine 2000轉染試劑購自賽默飛世兒科技公司；Dual-Luciferase Reporter Assay System購自美國普洛麥格公司；牛血清白蛋白、20×TBS、RT-qPCR/TaqMan One Step RT-qPCR Kit、PARP1抗體均購自北京索萊寶公司；RIPA裂解液購自上海源葉生物公司；Ki-67抗體購自武漢菲恩公司；PCNA鼠單抗、MDR1兔單抗、BCL-2鼠單抗、Bax兔單抗均購自美國CST公司；生物安全柜購自濟南鑫貝西生物公司；生物顯微鏡購自日本奧林巴斯株式會社；恒溫培養箱購自韓國DAIHAN公司；倒置熒光顯微鏡購自日本尼康株式會社；流式細胞儀購自常州必達科生物公司；凝膠成像系統購自美國Axygen公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養和轉染 A549和A549/DDP細胞培養在(含10%FBS、1%青霉素鏈霉素和1 mmol/L丙酮酸鈉)RPMI 1640培養基中。BEAS-2B細胞培養在(含10%FBS、1%青霉素鏈霉素和1 mmol/L丙酮酸鈉)DMEM(高糖)培養基中。此外，將A549/DDP細胞培養在含2 mg/L順鉑的培養基中，以保留耐藥表型[4]。將BEAS-2B、A549和A549/DDP細胞置入37 ℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養。100 mm培養皿中細胞密度為1 107個細胞時最佳。48～72 h后換液，進行細胞的傳代，取對數期生長旺盛的細胞進行后續的試驗。轉染時，A549/DDP細胞密度融合70%～80%時效果最佳。根據Lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行A549/DDP細胞的轉染。

1.2.2CCK-8 檢測正常肺細胞系BEAS-2B、肺癌細胞系A549和順鉑耐藥肺癌細胞A549/DDP的IC50值將BEAS-2B、A549和A549/DDP細胞分別接種于96孔板(1×105/孔)，每組至少設置6個復孔。37 ℃恒溫培養箱孵育，每孔加入10 μL CCK-8(0.5 mg/mL)，培養4 h。培養結束后，在酶標儀上測定波長在450 nm處各孔細胞的光密度值。

1.2.3RT-qPCR檢測OIP5-AS1、miR-7-5p和PARP1的表達水平 轉染后24 h內收集細胞，加入Trizol試劑提取正常肺細胞系BEAS-2B，肺癌細胞系A549和順鉑耐藥肺癌細胞A549/DDP中的總RNA。按照TaqMan One Step RT-qPCR Kit說明書將總RNA逆轉錄為cDNA，再進行qPCR。檢測OIP5-AS1和miR-7-5p、PARP1表達水平的RNA。根據每個基因序列利用Primer Premier 6.0設計引物。根據熒光定量，計算所有樣品和標準品的循環閾值(cycle threshold, Ct)。基于該標準的Ct值，繪制標準曲線，然后使用2-ΔΔCt方法進行定量計算。

1.2.4雙熒光素酶報告分析 使用生物信息學軟件StarBase和TargetScan對OIP5-AS1、miR-7-5p和PARP1的靶向關系進行預測。用Dual-Luciferase Reporter Assay System進一步驗證靶向關系。用PCR擴增含有miR-7-5p結合位點的OIP5-AS1基因的3′UTR序列。將OIP5-AS1的3′UTR克隆到pMIR-REPORT熒光素酶載體pMIR-OIP5-AS1-wild type中。通過PCR擴增OIP5-AS1 3′UTR結合位點的突變，克隆到pMIR-OIP5-AS1-mutant質粒中。根據Lipofectamine 2000轉染試劑說明書將miR模擬物(miR-7 mimic)和熒光素酶質粒pMIR-OIP5-AS1(野生型/突變型，WT/MUT)轉染到A549/DDP細胞中。轉染48 h后，棄去舊培養基，用PBS清洗細胞2次。隨后，在每孔細胞中加入100 μL裂解緩沖液(passive lysis buffer, PLB)，室溫下輕輕震蕩15 min，收集細胞裂解液。取20 μL PLB加入發光板中，用GloMax生物發光檢測儀讀取背景值2 s，每個樣品加入100 μL LAR Ⅱ 工作液，快速混勻，讀值2 s。讀值完畢后，每個樣品再加入100 μL Stop&Gl Reagent，快速混勻后，放入發光板中檢測，讀值2 s。熒光顯微鏡開啟或關閉30 min以內不可關閉或開啟。

1.2.5克隆形成檢測 A549/DDP細胞的生長轉染pLenti-CMV-PARP1于A549/DDP細胞，用克隆形成分別檢測敲除OIP5-AS1和PARP1過表達后A549/DDP細胞的生長情況。以200個細胞/皿的速度接種于60 mm培養皿中。敲除OIP5-AS1后將A549/DDP細胞分為4組：對照組(Control組)、sh-OIP5-AS1組、miR-7-5p inhibitor組、sh-OIP5-AS+inhibitor組。PARP1過表達后將A549/DDP細胞分為4組：對照組(A549/DDP)、sh-OIP5-AS1組、pLenti-CMV-PARP1組、sh-OIP5-AS1+PARP1組。處理24 h后，用新鮮培養基代替舊培養基。細胞經Giemsa染色后培養14天，計數含>50個細胞的菌落。確定細胞生長情況。

1.2.6Western blot法 采用Western blot法檢測A549/DDP細胞中Ki-67、PCNA、MDR1、BCL-2、Bax和PARP1的表達水平。用預冷的PBS洗滌A549/DDP細胞2次，在RIPA裂解液中裂解。細胞裂解液以12 000g離心15 min。通過Bradford法測定蛋白質含量。用由1%聚丙烯酰胺溶解凝膠和8%堆積凝膠組成的不連續系統電泳分級分離蛋白質樣品(100 g)，然后轉移至硝酸纖維素膜(KALANG)。以100 V和250 mA(電流常數)通電70 min。洗膜，用5%BSA在TBS中封膜1 h。加入一抗Ki-67(1 ∶2 000)、PCNA(1 ∶2 000)、MDR1(1 ∶3 000)、BCL-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)和PARP1(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜。加入二抗室溫下孵育2 h。用化學發光劑觀察條帶。通過酶聯免疫斑點圖像分析儀分析在硝酸纖維素膜上捕獲的信號來確定各蛋白的表達水平。試驗中的蛋白表達水平相對于GAPDH表示。

1.2.7流式細胞術檢測細胞凋亡情況 收集對照組(A549/DDP)、sh-OIP5-AS1、pLenti-CMV-PARP1和sh-OIP5-AS1+PARP1組中A549/DDP細胞，在500 μL結合緩沖液中重懸復蘇。每個樣品中分別加入200 μL的Annexin V-FITC和PI(10 μg/mL)，在室溫中避光孵育15 min。通過流式細胞儀檢測A549/DDP細胞凋亡情況。

2 結果

2.1 A549/DDP細胞中OIP5-AS1、miR-7-5p、PARP1的表達CCK-8實驗結果顯示，與BEAS-2B細胞相比，A549細胞IC50值明顯增加(P<0.05，圖1)，A549/DDP細胞IC50值顯著增加(P<0.01)。RT-qPCR檢測顯示，與BEAS-2B細胞相比，A549細胞OIP5-AS1、PARP1表達顯著升高(P<0.05，圖2)，miR-7-5p表達顯著降低(P<0.05)；A549/DDP細胞OIP5-AS1、PARP1表達極顯著升高(P<0.01)，miR-7-5p表達極顯著降低(P<0.01)。本實驗選擇A549/DDP細胞進行后續試驗。

圖1 BEAS-2B、A549和A549/DDP細胞中IC50值：與BEAS-2B細胞相比，*P<0.05，**P<0.01

圖2 RT-qPCR檢測BEAS-2B、A549和A549/DDP細胞中OIP5-AS1、miR-7-5p、PARP1的表達：與BEAS-2B細胞相比，*P<0.05，**P<0.01

2.2 OIP5-AS1和miR-7-5p的靶向關系通過生物信息學軟件StarBase對OIP5-AS1和miR-7-5p的靶向關系進行預測。結果發現，在has-miR-7-5p區域存在lncRNA OIP5-AS1的潛在結合位點(圖3)，說明miR-7-5p是OIP5-AS1的靶向調節基因之一。RT-qPCR檢測敲除OIP5-AS1后A549/DDP細胞中miR-7-5p的表達水平：與對照組相比，sh-OIP5-AS1組miR-7-5p表達顯著增加(P<0.01，圖4)，miR-7-5p inhibitor組miR-7-5p表達顯著降低(P<0.05)；與miR-7-5p inhibitor組相比，sh-OIP5-AS1+inhibitor組miR-7-5p表達明顯增加(P<0.05)。用RT-qPCR檢測過表達OIP5-AS1后A549/DDP細胞中miR-7-5p的表達水平：與對照組相比，Ad-OIP5-AS1組miR-7-5p表達明顯降低(P<0.05，圖5)，miR-7-5p mimic組miR-7-5p表達顯著增加(P<0.01)；與miR-7-5p mimic組相比，Ad-OIP5-AS1+mimic組miR-7-5p表達顯著降低(P<0.05)。雙熒光素酶報告驗證OIP5-AS1和miR-7-5p的靶向關系，過表達miR-7-5p后OIP5-AS1-WT組的熒光素酶活性明顯低于OIP5-AS1-MUT組(圖6)，證明OIP5-AS1和miR-7-5p之間確實存在著靶向關系，且miR-7-5p受OIP5-AS1的負調控作用。

圖3 OIP5-AS1與miR-7-5p結合區域及突變區域

圖4 RT-qPCR檢測敲除OIP5-AS1后A549/DDP細胞中miR-7-5p的表達水平：與Control組相比，*P<0.05，**P<0.01；與miR-7-5p inhibitor組相比，#P<0.05

圖5 RT-qPCR檢測過表達OIP5-AS1后A549/DDP細胞中miR-7-5p的表達水平：與Control組相比，*P<0.05，**P<0.01；與miR-7-5p mimic組相比，#P<0.05

圖6 雙熒光素酶報告驗證OIP5-AS1和miR-7-5p的靶向關系

2.3 敲除OIP5-AS1對A549/DDP細胞IC50值的影響CCK-8實驗結果顯示，與Control組相比，sh-OIP5-AS1組A549/DDP細胞IC50值明顯降低(P<0.05，圖7)，miR-7-5p inhibitor組A549/DDP細胞IC50值明顯增加(P<0.05)。與miR-7-5p inhibitor組相比，sh-OIP5-AS1+inhibitor組A549/DDP細胞IC50值顯著降低(P<0.05)。

圖7 CCK-8法檢測敲除OIP5-AS1后A549/DDP細胞IC50值：與Control組相比，*P<0.05，**P<0.01；與miR-7-5p inhibitor組相比，#P<0.05

2.4 敲除OIP5-AS1對A549/DDP細胞生長的影響克隆形成分析實驗發現，與Control組相比，sh-OIP5-AS1組A549/DDP細胞生長明顯減少(P<0.05，圖8)，miR-7-5p inhibitor組A549/DDP細胞生長明顯增加(P<0.05)。與miR-7-5p inhibitor組相比，sh-OIP5-AS1+inhibitor組A549/DDP細胞生長明顯減少(P<0.05)。

圖8 克隆形成檢測敲除OIP5-AS1后A549/DDP細胞生長：A.Control組；B.sh-OIP5-AS1組；C.miR-7-5p inhibitor組；D.sh-OIP5-AS1+inhibitor組

2.5 敲除OIP5-AS1后Ki-67、PCNA、MDR1蛋白表達Western blot分析顯示，與Control組相比，sh-OIP5-AS1組Ki-67、PCNA、MDR1表達明顯降低(P<0.05，圖9)，miR-7-5p inhibitor組Ki-67、PCNA、MDR1表達明顯增加(P<0.05)。與miR-7-5p inhibitor組相比，sh-OIP5-AS1+inhibitor組Ki-67、PCNA、MDR1表達明顯降低(P<0.05)。

圖9 Western blot法檢測敲除OIP5-AS1后A549/DDP細胞Ki-67、PCNA、MDR1蛋白表達

2.6 敲除OIP5-AS1對A549/DDP細胞凋亡的影響利用流式細胞術分析顯示，與Control組相比，sh-OIP5-AS1組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05，圖10)，miR-7-5p inhibitor組細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。與miR-7-5p inhibitor組相比，sh-OIP5-AS1+inhibitor組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。

圖10 敲除OIP5-AS1促進A549/DDP細胞凋亡：A.Control組；B.sh-OIP5-AS1組；C.miR-7-5p inhibitor組；D.sh-OIP5-AS1+inhibitor組

2.7 敲除OIP5-AS1后Bax、BCL-2蛋白表達Western blot分析顯示，與Control組相比，sh-OIP5-AS1組BCL-2表達明顯降低(P<0.05，圖11)，Bax表達明顯增加(P<0.05)，miR-7-5p inhibitor組A549/DDP細胞中BCL-2表達明顯增加(P<0.05)，Bax表達明顯降低(P<0.05)。與miR-7-5p inhibitor組相比，sh-OIP5-AS1+inhibitor組BCL-2表達明顯降低(P<0.05)，Bax表達明顯增加(P<0.05)。

圖11 Western blot法檢測敲除OIP5-AS1后A549/DDP細胞Bax、BCL-2蛋白表達

2.8 敲除OIP5-AS1調節miR-7-5p/PARP1軸增強A549/DDP細胞的化學敏感性通過生物信息學軟件TargetScan分析預測結果顯示，PARP1 3′UTR的685～692 bp區域存在has-miR-7-5p的潛在結合位點，故PARP1是miR-7-5p的靶向調節基因之一(圖12)；轉染pLenti-CMV-PARP1于A549/DDP細胞，利用Western blot檢測Control組、sh-OIP5-AS1組、pLenti-CMV-PARP1組和sh-OIP5-AS1+PARP1組中PARP1、Ki-67、MDR1和BCL-2的表達水平。與Control組相比，sh-OIP5-AS1組中PARP1、Ki-67、MDR1、BCL-2表達明顯降低(P<0.05，圖13)，pLenti-CMV-PARP1組PARP1、Ki-67、MDR1、BCL-2表達明顯增加(P<0.05)；與pLenti-CMV-PARP1組相比，sh-OIP5-AS1+PARP1組PARP1、Ki-67、MDR1、BCL-2表達明顯降低(P<0.05)。用克隆形成分析檢測A549/DDP細胞的生長，流式細胞術檢測細胞的凋亡。與Control組相比，sh-OIP5-AS1組中細胞凋亡率明顯升高(P<0.05，圖14)，細胞生長明顯減少(P<0.05，圖15)；pLenti-CMV-PARP1組細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，細胞生長明顯增加(P<0.05)。與pLenti-CMV-PARP1組相比，sh-OIP5-AS1+PARP1組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，細胞生長明顯減少(P<0.05)。

圖12 PARP1與miR-7-5p結合區域及突變區域

圖13 Western blot法檢測PARP1、Ki-67、MDR1、BCL-2蛋白表達

圖14 流式細胞術檢測細胞凋亡：A.Control組；B.sh-OIP5-AS1組；C.pLenti-CMV-PARP1組；D.sh-OIP5-AS1+PARP1組

圖15 克隆形成檢測細胞生長：A.Control組；B.sh-OIP5-AS1組；C.pLenti-CMV-PARP1組；D.sh-OIP5-AS1+PARP1組

3 討論

肺癌是男性預后較差的癌癥之一[4]，以腺癌和鱗癌為主要亞型，NSCLC為主要的組織病理學亞型。研究發現，FOXD2-AS1/miR185-5p通過增強順鉑耐藥癌細胞的化學敏感性，抑制NSCLC[5]。lncRNA TUG1通過削弱miR-221依賴的PTEN，增強NSCLC的化學敏感性[6]。本實驗通過增強化學敏感性來探究lncRNA和miRNA相互作用對NSCLC的作用和分子機制。本實驗檢測了順鉑對正常肺細胞系BEAS-2B、肺癌細胞系A549和順鉑耐藥肺癌細胞A549/DDP的IC50值。結果發現，順鉑對A549/DDP細胞的毒性作用遠遠小于BEAS-2B和A549。因此，本實驗利用A549/DDP細胞進行后續試驗。此外，A549/DDP細胞中OIP5-AS1高表達，miR-7-5p低表達。表明OIP5-AS1和miR-7-5p可能參與A549/DDP細胞對順鉑的耐藥性。

lcnRNA調控基因表達程序，影響特定的細胞過程。lcnRNA形成一組核酸，參與多種不同的細胞機制，包括增殖、分化、凋亡和衰老[2]。lcnRNA OIP5-AS1抑制GAK表達控制有絲分裂。lcnRNA OIP5-AS1為NSCLC的生物標志物。OIP5-AS1可靶向多種miRNA來調節肺癌的發生。Wang等[7]發現，OIP5-AS1通過靶向miR-378a-3p促進肺癌細胞增殖，導致預后不良。本實驗利用RT-qPCR檢測BEAS-2B、A549和A549/DDP細胞中OIP5-AS1的表達水平，結果顯示，A549/DDP細胞中OIP5-AS1高表達；且敲除OIP5-AS1后，A549/DDP細胞生長被抑制，化學敏感性增強，A549/DDP細胞凋亡增加。

microRNAs(miRNAs)是單鏈非編碼、長度在20～25個核苷酸之間的RNA，在真核生物中廣泛表達。不同的miRNA根據其特定的表達模式、靶基因表達或細胞環境，能夠同時作為癌基因和抑癌基因發揮作用[8]。miRNA是腫瘤進展的關鍵調控因子，研究發現，miR-7-5p通過靶向PAK2，誘導NSCLC細胞生長抑制、細胞周期阻滯和凋亡[9]。miR-7-5p可以有效治療NSCLC產生的細胞學效應[10]。本實驗利用RT-qPCR檢測BEAS-2B、A549和A549/DDP細胞中miR-7-5p的表達水平，并通過生物信息學軟件預測了miR-7-5p的潛在靶標。結果顯示，A549/DDP細胞中miR-7-5p低表達。miR-7-5p是OIP5-AS1的靶向調節基因之一，且兩者之間為負相關調控。

PARP1在癌癥的臨床治療中，被認為是通過抑制PARP1聚合酶和捕獲PARP1-DNA來發揮其細胞毒性[11]。PARP1在軟組織肉瘤中被認為是潛在的治療靶點[12]。研究發現，通過抑制PARP1表達可以緩解順鉑抗癌治療的副作用[13]。花生黃酮作為一種強效高選擇性PARP1抑制劑，能夠增強NSCLC的抗癌作用[14]。PARP1在NSCLC組織中被微囊藻毒素上調，抑制癌細胞增殖[15]。miR-7-5p介導的PARP1下調影響小細胞肺癌DNA同源重組的修復和對阿霉素的耐藥性[16]。同樣地，本實驗通過生物信息學軟件TargetScan對miR-7-5p和PARP1的靶向關系進行預測，結果顯示，PARP1是miR-7-5p的靶向調節基因之一，且兩者之間為負向調控關系。下調PARP1可以增強A549/DDP細胞的化學敏感性，抑制NSCLC。

本實驗結果表明，lncRNA OIP5-AS1通過上調miR-7-5p或下調PARP1，增強A549/DDP細胞的化學敏感性，抑制NSCLC。