甲狀腺癌中LZTS2蛋白表達及與BRAFV600E基因突變的關系

張亞麗，李絲冰，王 藝，張 賀，張其棟，夏慶欣

甲狀腺癌(thyroid carcinoma, TC)發病率在全球呈逐年上升趨勢[1]。Haugen等[2]報道TC發病率雖然較高，但患者臨床預后普遍較好。影響TC患者預后的因素很多，如轉移(淋巴結或遠隔臟器)、基因突變及缺氧誘導微環境等[3]。亮氨酸拉鏈腫瘤抑制因子2(leucine zipper tumor suppressor 2, LZTS2)基因是近年新發現的抑癌基因[4]，其為腫瘤的治療提供新的方向。已有研究表明LZTS2在正常前列腺、卵巢組織中高表達，且與多種腫瘤包括鼻咽癌、肺癌、胃癌、乳腺癌及神經膠質瘤等腫瘤發生、發展及患者預后具有相關性[5-8]。但有關LZTS2在TC中的表達及生物學作用尚未見相關報道。BRAF基因突變見于多種疾病，在TC中(尤其甲狀腺乳頭狀癌)以BRAFV600E基因突變發生率最高[9]，BRAFV600E基因突變與影響TC患者預后的因素如淋巴結轉移、包膜侵犯及TNM分期等有相關性。有研究表明[10]，LZTS2/LAPSER1基因與相關基因或蛋白在腫瘤的發生、發展過程中存在協同或抑制作用。本組通過免疫組化法檢測TC組織中LZTS2蛋白表達，并通過熒光PCR法檢測BRAFV600E基因突變情況，探討兩者相關性，著重分析LZTS2蛋白表達與TC臨床病理特征的關系，以期為TC患者的不良預后提供更多合理的生物標志物，進而為臨床個體化治療提供可靠的依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取鄭州大學附屬腫瘤醫院病理科2016年1月～2019年10月經病理確診的140例TC(包括48例甲狀腺乳頭狀癌、41例甲狀腺濾泡癌、23例未分化癌、28例髓樣癌)腫瘤組織作為實驗組，其中67例TC患者術前行超聲引導下甲狀腺結節細針穿刺新鮮組織BRAFV600E基因突變檢測，并選取82例結節性甲狀腺腫組織作為對照組。回顧性分析實驗組TC患者的臨床病理資料。腫瘤TNM分期標準采用美國癌癥聯合會(American joint committee on cancer, AJCC)第8版標準。納入標準：(1)切片由兩位高級職稱病理醫師診斷；(2)患者在本次治療前未接受放、化療；(3)臨床與病理資料完善；(4)心、肝腎功能正常。排除標準：(1)合并其他類型惡性腫瘤；(2)臨床病理資料不齊全；(3)合并精神障礙者。

1.2 主要試劑兔抗人LZTS2單克隆抗體(ATLAS，克隆號R41398，稀釋濃度1 ∶100)；人類BRAF基因突變檢測試劑盒(北京雅康博生物公司)；DAB顯色試劑盒、SP試劑盒(美國Ventana公司)等。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 標本經10%中性福爾馬林固定、脫水、包埋、切片和HE染色。免疫組化采用Ventana Benchmark XT自動免疫組化儀染色。顯微鏡(OLYMPUS BX41)下觀察LZTS2的表達。判讀標準：由兩位經驗豐富的高級職稱病理醫師采用雙盲法在高倍顯微鏡下對染色結果進行觀察，主要觀察記錄陽性細胞率和著色強度，LZTS2陽性主要定位于細胞質/膜。按陽性細胞百分比評分：陽性細胞率<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；按著色強度評分：基本無陽性著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；兩項評分相乘為最終得分：0～4分為低表達，>4分為高表達。

1.3.2穿刺方法 甲狀腺結節細針穿刺檢查均為超聲引導下穿刺，操作嚴格遵循無菌原則。最后將穿刺注射器內部分穿刺物快速推至含有1 mL生理鹽水的離心管中用于基因檢測。

1.3.3BRAFV600E基因突變檢測 使用QIAamp DNA Micro Kit提取穿刺組織DNA，按人類BRAF基因突變檢測試劑盒(北京雅康博公司)操作說明，采用PCR法判斷基因是否突變。

1.4 統計學方法采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。率的比較采用χ2檢驗及Fisher精確概率法。多因素分析采用Logistic回歸分析，LZTS2蛋白表達與BRAFV600E基因突變的關系進行Pearson相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TC及結節性甲狀腺腫組織中LZTS2的表達LZTS2蛋白主要定位于細胞質/膜(圖1)，LZTS2在TC組織中的低表達率為37.14%(52/140)，結節性甲狀腺腫中的低表達率為19.51%(16/82)，差異有統計學意義(χ2=7.565，P<0.05，表1)。此外，實驗組LZTS2在甲狀腺濾泡癌、未分化癌中的低表達率(41.46%、100%)與結節性甲狀腺腫(19.51%)相比，差異均有統計學意義(P<0.05)。

表1 TC及結節性甲狀腺腫組織中LZTS2的表達[n(%)]

ABC圖1 A.甲狀腺乳頭狀癌中LZTS2高表達,EnVision法;B.結節性甲狀腺腫中LZTS2高表達,EnVision法;C.甲狀腺未分化癌中LZTS2低表達,EnVision法

2.2 LZTS2蛋白表達與TC臨床病理特征的關系TC組織中LZTS2蛋白表達與患者年齡、TNM分期、組織學類型、腫瘤直徑及病灶數目有關(P<0.05)；與患者性別、淋巴結轉移及雙側甲狀腺受累均無關(P>0.05，表2)。多因素Logistic回歸分析顯示，LZTS2蛋白低表達與TC不同組織學類型顯著相關(OR=0.33，95%CI：0.16～0.72，P<0.05)。

表2 LZTS2蛋白表達與TC臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3 BRAFV600E基因突變檢測實驗組中67例TC患者行超聲引導下甲狀腺結節細針穿刺新鮮組織檢測BRAFV600E基因突變情況。甲狀腺乳頭狀癌BRAFV600E基因突變率為95.45%(42/44)，髓樣癌及濾泡癌均未合并BRAFV600E基因突變。單因素分析顯示，BRAFV600E基因突變與TC不同組織學類型具有相關性(P<0.001，圖2、3)。

圖2 A.甲狀腺乳頭狀癌HE染色；B.熒光PCR檢測示BRAFV600E基因突變型

圖3 A.甲狀腺未分化癌：梭形腫瘤細胞間質內彌漫浸潤性生長；B.熒光PCR檢測示BRAFV600E基因野生型

2.4 LZTS2表達與BRAFV600E基因突變的關系本組TC中LZTS2蛋白表達與BRAFV600E基因突變無明顯相關性(r=0.225，P=0.067，表3)。

表3 TC中LZTS2表達與BRAFV600E基因突變的關系[n(%)]

3 討論

TC屬于頭頸部常見的惡性腫瘤，發病率逐年升高，主要與臨床影像學檢查的普及、細針穿刺細胞學診斷水平的提高有關[11]。TC組織學類型包括乳頭狀癌、濾泡癌、未分化癌及髓樣癌，其中以乳頭狀癌最為常見且患者預后較好，未分化癌患者預后最差[12]。目前TC發生、發展機制尚不完全明確，深入探討TC可能的發生機制，可為TC的早期預防及后期治療提供更多實驗依據，且對于改善患者預后有重要臨床意義。

LZTS屬于富含亮氨酸重復序列超家族蛋白，主要包括LZTS1和LZTS2。LZTS2是近年發現的包含3個亮氨酸拉鏈結構域的蛋白，LZTS2/LAPSER1基因位于人類染色體10q24.3[13]。LZTS2蛋白N-末端的PGS富集區和SGP富集區和C-末端的谷氨酸富集區是其結合于各轉錄因子的重要結構，其含有3個結構域可以直接結合DNA的啟動子或增強子，調控基因的轉錄。LZTS2蛋白在很多正常組織中高表達，但在腫瘤組織(如肺癌、結腸癌、膠質瘤及前列腺癌等)中低表達，也提示LZTS2可能是一種發揮抑癌作用的蛋白[14]。但有關LZTS2蛋白在TC組織中的表達及生物學作用尚未見報道。本實驗通過免疫組化法檢測TC及結節性甲狀腺腫組織中LZTS2蛋白的表達，結果顯示TC組織中LZTS2蛋白顯著低表達，與文獻報道一致。Cui等[6]研究發現，非小細胞肺癌中LZTS2/LAPSER1表達率較低，且LZTS2/LAPSER1過表達與非小細胞肺癌類型、腫瘤狀態和淋巴結侵襲情況有關。本組通過單因素分析發現，TC組織中LZTS2低表達與組織學類型(濾泡癌低表達率41.46%、未分化癌低表達率100%)有相關性，且多因素分析結果顯示組織學類型是LZTS2低表達的獨立影響因素，與以往研究認為LZTS2主要發揮抑癌作用的觀點一致。但本實驗還發現，甲狀腺乳頭狀癌、髓樣癌組織中LZTS2蛋白高表達，與部分文獻報道不一致[7]，考慮可能與TC病變發生發展過程中存在LZTS2/LAPSER1基因突變的現象有關。LZTS1和LZTS2屬于同一家族的抑癌基因，王欣欣等[15]通過對肝癌中LZTS1蛋白表達的研究發現，對比正常肝細胞，肝癌細胞系HepG2中LZTS1表達反向增強。由此作者考慮LZTS2蛋白在部分TC組織中可能也存在類似的反向表達，但仍需后續進一步深入研究證實。本組LZTS2蛋白表達與患者年齡、腫瘤TNM分期、腫瘤直徑及病灶數目有相關性，提示LZTS2蛋白表達可能與TC病情進展及患者預后有關。

作為RAF基因家族中的一種，BRAF基因突變見于多種疾病，尤以BRAFV600E基因突變與TC發生最具相關性，甲狀腺惡性結節(乳頭狀癌)中BRAFV600E基因突變率為64.58%，而良性結節不合并BRAFV600E基因突變[16]。本組甲狀腺乳頭狀癌BRAFV600E基因突變率為95.45%(42/44)，高于文獻報道結果，可能與研究對象選擇、樣本量及檢測方法不同等因素有關。研究發現[10]LZTS2/LAPSER1基因與相關基因或蛋白在腫瘤的發生發展過程中存在協同或抑制作用。本實驗結果顯示LZTS2蛋白表達與BRAFV600E基因突變不具有相關性，提示兩者在TC發生、發展過程中可能各自發揮不同的影響作用。

綜上所述，本組通過免疫組化法、單因素及多因素分析發現，LZTS2蛋白在TC組織(濾泡癌、未分化癌)中呈低表達，間接證實在甲狀腺組織中LZTS2也是一種發揮抑癌作用的蛋白。LZTS2蛋白表達與BRAFV600E基因突變不具有相關性，兩者在TC發生、發展過程中可能各自發揮不同的作用，LZTS2有望成為TC早期預警生物學標志物。有關LZTS2在TC中的具體作用機制尚不清楚，尚需進一步的實驗來驗證。