新舊指南下乳腺癌HER-2基因狀態和蛋白表達及與臨床病理關系的比較和再評價

羅斯譯，高子清，陳 麗，肖秀麗，阮思蓓，張翠微，凌 鳳，吳 寧，唐明希

乳腺癌是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤，20%～30%乳腺癌患者存在HER-2過表達或擴增，而HER-2過表達或擴增患者對赫賽汀等靶向藥物敏感性高[1]。因此，通過免疫組織化學(immunohistochemistry, IHC)和熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)正確檢測和評價HER-2狀態對乳腺癌治療方案的選擇和預后評估極其重要。目前，我國最新《乳腺癌HER2檢測指南(2019版)》(以下簡稱新指南)已經發布[2]，本文根據新指南再評價1 518例乳腺癌患者IHC和FISH檢測結果的一致性及其與各臨床病理特征的關系，并比較分析與《乳腺癌HER2檢測指南(2014版)》(以下簡稱舊指南)[3]指南下判讀結果的異同和優劣，為乳腺癌患者正確選擇治療方案和預后評估，特別是抗HER-2陽性靶向治療患者個體化方案和預后療效評估提供更為合理的參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取2010年11月～2019年10月經西南醫科大學附屬醫院病理科確診為浸潤性乳腺癌并行FISH和IHC檢測的女性乳腺癌患者1 518例。組織標本主要來源于四川地區瀘州、宜賓、內江、自貢、德陽等及川、滇、黔、渝結合部地區人群。文獻報道乳腺浸潤性導管癌穿刺標本與手術標本HER-2蛋白表達具有較高的一致性[4]，因此本實驗選取浸潤性乳腺癌根治手術切除標本和粗針穿刺標本，其中根治手術標本1 343例、粗針穿刺標本175例，年齡17～90歲。所有病例均有完整的FISH報告記錄和ER、PR、HER-2等IHC切片及臨床病理資料。根據新、舊指南中IHC和FISH判讀標準對所有病例進行再判讀和差異統計分析。FISH再判讀主要通過查閱檢測報告記錄，IHC再判讀由2名教授復閱切片完成。

1.2 試劑與探針IHC中ER(SP1)、PR(1E2)和HER-2(4B5)檢測使用羅氏公司抗體；Ki-67(MIB.I)抗體由北京中杉金橋公司提供。FISH檢測采用北京金普嘉公司HER-2基因擴增試劑盒。

1.3 方法

1.3.1IHC法 新鮮標本經10%中性福爾馬林固定后石蠟包埋并連續3 μm厚切片，IHC操作步驟嚴格按照EnVision兩步法試劑盒說明書進行，ER、PR、Ki-67陽性為細胞核呈棕色或棕褐色，HER-2陽性為細胞膜呈棕色。

1.3.2FISH法 按照北京金普嘉公司HER-2基因擴增試劑盒操作說明書進行FISH檢測，具體操作步驟參照文獻[5-6]。

1.4 結果判斷

1.4.1IHC結果判斷 HER-2蛋白表達強度判讀參照新版指南[2]進行，與舊版[3]不同者主要為：針對IHC(2+)判讀的第一種情況，由舊版本的>10%的浸潤癌細胞呈現不完整和(或)弱至中等強度的細胞膜染色，改為>10%的浸潤癌細胞呈現弱/中等強度的完整細胞膜染色。

1.4.2FISH結果判讀 新、舊指南不同之處主要為：(1)舊指南HER-2/CEP17比值≥2.0判讀為陽性，新指南還需結合平均HER-2拷貝數/細胞≥4.0才能判為陽性，對HER-2/CEP17比值≥2.0但HER-2拷貝數/細胞<4.0者，新指南還需增加細胞計數，結果不變者判為陰性。(2)舊指南中HER-2/CEP17比值<2.0，但平均HER-2拷貝數/細胞≥6.0者判讀為陽性，新版下還需增加細胞計數，結果不變者判為陽性。(3)舊指南HER-2/CEP17比值<2.0，平均HER-2拷貝/細胞數≥4.0且<6.0判為可疑，新指南要重新計數細胞后綜合判讀，若結果仍不變還需結合IHC結果進行判讀，若IHC(3+)則判為陽性，若IHC(0～2+)則判為陰性。

1.5 統計學分析采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，HER-2基因狀態及蛋白表達與臨床病理特征的關系采用χ2檢驗及Gamma關聯分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌中HER-2蛋白表達和HER-2基因擴增情況1 518例乳腺癌組織標本中，HER-2蛋白(-/+)者視為陰性，合計251例(16.53%)，(2+)和(3+)者均視為陽性，分別為1 084例(71.41%)和183例(12.06%)。HER-2基因擴增406例(26.75%)，無擴增1 112例(73.25%)(圖1～4)。

①②③④

2.2 IHC和FISH檢測乳腺癌中HER-2蛋白表達、基因擴增的一致性新指南下，HER-2蛋白陽性率為83.47%(1 267/1 518)，HER-2基因擴增率為26.75%(406/1 518)。在1 267例HER-2蛋白陽性患者中有397例HER-2基因擴增，其中HER-2(2+)者263例，HER-2(3+)者134例，在406例HER-2基因擴增患者中有9例HER-2(-)。新、舊指南下HER-2蛋白表達和HER-2基因檢測結果均相關(r=0.233，P<0.001；r=0.780，P<0.001)；HER-2(-/+)和HER-2基因陰性的符合率分別為100%和95.36%；HER-2(2+)和HER-2(3+)與HER-2基因陽性的符合率分別為24.26%和73.22%。新、舊指南中IHC(2+)與FISH檢測符合率差異有統計學意義(P<0.001)，IHC(-/+)、IHC(3+)與FISH符合率差異無統計學意義(表1)。

表1 FISH及IHC檢測HER-2基因狀態和蛋白表達一致性

2.3 乳腺癌中HER-2基因擴增及HER-2蛋白表達與臨床病理特征的關系ER、PR、ER/PR表達狀態與HER-2基因擴增(χ2=229.674，P<0.001；χ2=93.935，P<0.001；χ2=96.466，P<0.001)及HER-2蛋白表達(χ2=65.436，P<0.001；χ2=92.133，P<0.001；χ2=41.207，P<0.001)差異有統計學意義；組織學分級與HER-2基因擴增及蛋白表達呈正相關(r=0.097，P<0.05；r=0.139，P<0.05)。ER表達與HER-2基因擴增及蛋白表達呈負相關(r=-0.606，P<0.001；r=-0.126，P<0.05)，PR、ER/PR狀態與HER-2基因擴增呈負相關(r=-0.428，P<0.001；r=-0.428，P<0.001)，與HER-2蛋白表達無關(P>0.05)。此外，Ki-67與HER-2基因擴增相關，腫瘤大小與HER-2蛋白表達相關，年齡及淋巴結數量與HER-2基因擴增及蛋白表達無顯著相關性(P>0.05，表2)。

表2 乳腺癌中HER-2蛋白表達、HER-2基因狀態與臨床病理特征的關系

3 討論

隨著抗HER-2陽性乳腺癌靶向藥物的廣泛應用，極大地提高了HER-2陽性患者的生存期[7]。因此，HER-2的精確檢測和評估對乳腺癌患者治療選擇和預后判斷具有重要意義。本實驗根據新版指南對四川及周邊地區1 518例乳腺癌患者FISH和IHC檢測結果的一致性及與臨床病理特征的關系進行了再評價，并與舊版指南結果進行了比較與分析。

新指南結果顯示：IHC(-)和FISH陰性的符合率為100%，與舊指南結果相同；IHC(+)和FISH陰性的符合率為95.36%，略高于舊指南(94.33%)，這與新指南結果新增2例FISH陰性有關。因為新指南考慮到目前臨床試驗數據中仍缺乏充分證據證明HER-2/CEP17比值≥2.0，平均HER-2拷貝數/細胞<4.0的患者能從HER-2靶向治療中獲益[8-9]，因此，新指南有效規避了舊指南標準下1例的FISH“假陽性”和1例“可疑”的判讀結果，對臨床用藥指導更為準確；新版指南下IHC(2+)和FISH陽性符合率為24.26%，略低于舊指南的25.65%，這與新指南刪除了“可疑”判讀標準有關，在新指南判讀標準下減少了15例FISH陽性和增加了79例FISH陰性結果，相應地有效規避了15例舊指南FISH“假陽性”和64例“可疑”結果的不確定性判讀，使臨床靶向藥物的應用更加準確和完善；新指南下IHC(3+)和FISH陽性符合率為73.22%，略高于舊指南的70.49%，這是基于新指南刪除“可疑”判讀從而新增了5例FISH陽性結果所致，同樣體現了新指南標準的更具明確性和科學性。因為現有的循證醫學依據顯示HER-2/CEP17比值<2.0，平均HER-2拷貝數/細胞≥4.0且<6.0(0～2+)患者能否從抗HER-2靶向治療中獲益，目前仍未得到充分證明[10-11]。

本組中IHC(2+)與FISH檢測的符合率差異有統計學意義，這與新指南取消64例HER-2“可疑狀態”判讀標準有關，體現了新標準下更為明確的判讀結果。新、舊指南間IHC(-/+)和IHC(3+)者與FISH檢測的符合率差異均無統計學意義，可能與本組中IHC(-/+)和IHC(3+)樣本量較少和舊標準“可疑判讀”例數較少有關。本組結果也體現了新指南對舊指南的有效補充與完善，并結合臨床實踐，使乳腺癌患者用藥標準及預后判斷更加明確和準確。本組中IHC(-/+)與FISH陰性具有高度的符合率(100%，95.36%)。但IHC(3+)與FISH陽性的符合率較低(73.22%)，與IHC(3+)樣本量較少[因臨床上只要IHC(3+)便可直接用靶向藥，而并不推薦再行FISH檢測]有關，并且多為5年以前的樣本，這與當時樣本固定也有關。除此以外，IHC檢測結果也受抗原修復方法的影響[12]。有報道顯示IHC(3+)伴FISH陽性者靶向用藥的預后要好于IHC(3+)但FISH陰性者[11]，且有研究認為HER-2拷貝數可為HER-2陽性浸潤性乳腺癌患者提供預后信息，HER-2拷貝數高的IHC(3+)和(2+)患者預后較好[13]。據此，我們認為IHC(2+～3+)者都應進一步行FISH檢測，以完善診斷，指導治療和判斷預后。

新、舊指南下，ER表達與HER-2基因擴增和HER-2蛋白表達均呈負相關。PR、ER/PR狀態與HER-2基因擴增也均呈負相關，與HER-2蛋白表達無相關性，提示ER、PR陰性患者預后較差可能與HER-2高表達及基因擴增有關，ER陰性者同時也與HER-2蛋白表達呈負相關；新指南下Ki-67增殖指數和HER-2基因擴增呈正相關，腫瘤大小和組織學分級與HER-2蛋白表達均呈正相關，與本組之前的報道一致[4-5]。另外，新指南判讀結果顯示乳腺癌患者年齡、淋巴結轉移數與HER-2基因擴增無相關性，與舊指南報道的呈正相關相反，可能的原因為新指南IHC(2+)時的判讀標準為“>10%的浸潤癌細胞呈現弱～中等強度的、完整細胞膜染色[2]”，取代了舊指南的“>10%的浸潤癌細胞呈現不完整和(或)中等強度的細胞膜染色[3]”的判讀；另外，新指南對舊指南中FISH判讀標準進行了補充和修改，取消了FISH“可疑”的判讀，避免了舊指南假陽性判斷，使FISH陽性和陰性例數發生了變化。由于本組樣本量的局限性，且僅限于四川及川、滇、黔、渝結合部地區患者，這些相關性的證實還有待長期、大量、多中心的回顧性研究來進一步證實與完善。

綜上所述，新版指南結合了HER-2/CEP17比值、平均HER-2基因拷貝數及臨床實踐，通過取消HER-2基因“可疑”判讀及IHC對HER-2蛋白結果判讀的影響等標準的修改，使臨床對HER-2狀態的診斷更為明確和合理，對乳腺癌患者靶向用藥及預后判斷更加精準和完善。