響應面法優選達原飲顆粒的提取工藝

歐陽煒　朱雅玲　洪篤云

摘要 目的：優選達原飲顆粒的最佳提取工藝。方法：采用Box-Behnken響應面法，以浸膏得率與厚樸酚、和厚樸酚含量的總評歸一值為評價指標，對達原飲顆粒提取工藝條件進行優選。結果：得到達原飲顆粒的最優值為提取次數2.42次，提取時間0.96 h，加溶劑量10倍，預測值OD=0.948，根據實際生產選擇最優條件為提取時間55 min，加水量10倍，提取2次，OD=0.895。結論：優選得到的提取工藝經驗證重復性高，結果穩定。

關鍵詞 達原飲顆粒;提取工藝;Box-Behnken響應面法;含量測定;厚樸酚;和厚樸酚;瘟疫;經典方

Abstract Objective：To optimize extraction process of Dayuan Granules.Methods：Based on Box-Behnken design-response surface method，the sum of the extraction yield，magnolol，and magnolol content were the evaluation index and the extraction process conditions of Dayuanyin Granules was optimized.Results：The optimal value of Dayuanyin Granules was 2.42 extraction times，0.96 h extraction time，10 times the amount of solvent added，and the predicted value OD=0.948.According to the actual production，the optimal conditions were selected as 55 minutes extraction time and 10 times the amount of water added.Extracted twice，OD=0.895.Conclusion：The optimized extraction process has been verified to have high repeatability and stable results.

Keywords Dayuan Granules; Extraction technology; Box-behnken response surface method;Content determination; Magnolol; Honokiol; Pestilence; Classic prescriptions

中圖分類號：R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.11.011

達原飲是明代吳又可《溫疫論》中的經典方，處方組成：檳榔、厚樸、草果、知母、芍藥、黃芩、甘草。具有開達膜原，辟穢化濁的功效。古代用于治療瘟疫、時疫，為疏利疫邪之要方。現代主要用于辨證為濕熱穢濁，郁伏膜原引發的發熱癥狀[1-2]。在各種流感病毒流行越來越猛烈的今天，西藥在治療上越顯乏力，在“SARS”“H7N9”“新型冠狀病毒”時期，中醫藥都發揮出了優勢，開發有臨床療效的經方驗方意義深遠[3-5]。本研究將采用Box-Behnken響應面法（BBD-RSM）對達原飲的制備工藝進行優選，并開發為院內制劑。BBD-RSM法是一種評估考察因素非線性影響的響應曲面方法，并根據函數表達式計算最優值，然后找到各考察因素間的最佳組合。因此，BBD-RSM能找到整個區域上的最佳水平。因擁有比正交實驗高的精密度，比其他響應面法較少的實驗次數，不需要多次連續實驗，且可以對實驗結果進行預測，常用于提取工藝尋找最優工藝[6]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1200型高效液相色譜儀、RE-52AA旋轉蒸發器（上海）、ZK-82A真空干燥箱（上海）、Bp211D電子分析天平（德國）。

1.2 試劑 對照品均購于中國食品藥品檢定研究院（厚樸酚：批號110729-201714、和厚樸酚：批號110730-201614）。甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。

1.3 分析樣品藥材 檳榔、厚樸、草果、知母、芍藥、黃芩、甘草由廣東省第二中醫院中藥房提供，經檢驗均符合《中華人民共和國藥典》2015版一部各飲片項下要求。

2 方法與結果

2.1 厚樸酚與和厚樸酚的含量測定[7]

2.1.1 色譜條件色譜柱 Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相：甲醇-水（70∶30）;波長：294 nm;柱溫：30 ℃;流速：1 mL/min。

2.1.2 對照品溶液制備分別精密稱取兩對照品，加甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，制成含厚樸酚924.1 mg/L的對照品溶液和含和厚樸酚463.6 mg/L對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備精密稱取達原飲提取液2 g，置100 mL具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL，精密稱重后超聲（500 W，40 kHz）30 min，放至常溫，精密稱重并加甲醇補重至超聲前重量，搖勻，濾過，取濾液。

2.1.4 陰性樣品溶液制備按達原飲提取液的提取方法，去除厚樸，制成陰性提取液，按照“2.1.3”項下方法制成陰性樣品溶液。

2.1.5 標準曲線的繪制分別精密吸取濃度為2、4、8、10、12、14 μL的厚樸酚對照品溶液、2、8、12、16、20、24 μL的和厚樸酚對照品溶液，橫坐標為對照品濃度（μg/mL），縱坐標為峰面積值，求得回歸方程：厚樸酚Y=39 727X+6 102.4，r=0.999 6;和厚樸酚Y=41 225X+1 622.1，r=0.999 7。厚樸酚在1.848～12.94 μg范圍內，和厚樸酚在0.927 2～11.13 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

2.1.6 精密度試驗精密吸取厚樸酚（924.1 mg/L）對照品溶液，和厚樸酚（463.6 mg/L）對照品溶液各10 μL，按照2.1.1項連續進樣6次，測得厚樸酚峰面積及和厚樸酚峰面積，RSD分別為0.64%、0.71%（n=6），符合RSD<2%的要求，該儀器精密度良好。

2.1.7 穩定性試驗精密吸取同一供試品溶液7份，按2.1.1項在制備后的0、2、4、6、8、10、12 h進樣分析，測得厚樸酚的RSD1.31%（n=6），和厚樸酚峰面積的RSD1.52%（n=6），供試品溶液在12 h內穩定。

2.1.8 重復性試驗按上面方法制得達原飲供試品溶液6份，進樣測定并計算厚樸酚與和厚樸酚的含量。厚樸酚含量的RSD為0.81%（n=6）、和厚樸酚含量的RSD為1.62%（n=6），表明該方法重現性良好。

2.1.9 加樣回收試驗取已知含量的達原飲提取液，分別加入適量厚樸酚與和厚樸酚對照品溶液（厚樸酚924.1 mg/L、和厚樸酚463.6 mg/L），制備供試品溶液并進行測定，計算加樣回收率，結果表明厚樸酚與和厚樸酚的平均回收率分別為101.2%，99.3%，RSD分別為1.35%、1.29%。

厚樸酚、和厚樸酚與其他組分的色譜圖見圖1。其中供試品的和厚樸酚出峰時間為4.32 min，峰面積為289 255.2，厚樸酚出峰時間為5.11 min，峰面積為321 883.01。

2.2 浸膏得率的測定

精密吸取達原飲濃縮液20 mL置己恒重的蒸發皿，水浴蒸干，按《中華人民共和國藥典》2015年版四部干燥失重測定法計算干膏得率。計算公式：干膏得率（%）=（W×V）/（20×Wt）×100%（W為20 mL濃縮液中干浸膏重量，V為定容體積，Wt為藥材重量）。

2.3 Box-Behnken效應面法試驗[8-10]

2.3.1 Box-Behnken優化設計 采用Design-Expert8.0.6軟件中的Box-Behnken試驗設計方案，選取提取時間（A）、加水量（B）、提取次數（C）作為影響因素，采用總評歸一值法（overalldesirability，OD）處理多指標數據。浸膏得率及含量指標越大越好，采用Hassan方法，求歸一值[11]。公式：di=（yi-ymin）/（ymax-ymin），OD=（d1d2d3……dk）1/k，i=1，2，3，…，n，k為指標數。見表1。

2.3.2 模型擬合及分析

運用Design-Expert8.0.6軟件，以總評OD值為響應值，采用多元二次回歸方程得到因素與響應值的方程為：OD=-2.275+1.657A+0.037 2B+1.761C-0.020 3AB-0.273AC-4.539×10-3BC-0.414A2+7.846×10-4B2-0.300 3C2，從表2中可以看出A、B、C、AC、A2、C2均具有統計學意義，影響提取效果為C>A>B，F=64.59，模型項P<0.000 1，模型高度顯著，實驗誤差小。失擬項F=1.76，P=0.293 9>0.05，表明失擬項無統計學意義，相關系數R2=0.998 8，說明模型擬合度好，回歸方程能準確預測實際情況。綜上所述，模型可以有效的優化出達原飲顆粒的最佳提取工藝，且實用性強。

2.4 效應面分析及實驗預測

采用Design-Expert8.0.6軟件，根據回歸分析結果，固定其中的某1個因素，繪制另外2個因素對總評OD值影響的三維曲面和等高線圖（圖2）。當等高線圖呈橢圓形，越接近最佳值，面的彎曲度就越大。圖中紅點為最高點，等高線呈橢圓形，3D圖陡峭，表示交互作用顯著。在C因素方向的響應面曲線明顯比A、B因素方向較陡，說明C因素對響應值OD的影響高于A、B因素。從圖2中可以看出，AC具有顯著性交互作用，這和方差分析的結果相一致。經軟件計算得到達原飲顆粒的提取工藝參數最優值為提取次數2.42次，提取時間0.96 h，加水量10倍，預測值OD=0.948。因提取次數需要取整數，經單因素試驗，提取3次相比于提取2次效果并不很顯著，將提取次數定為2次。最終選擇為提取2次，55 min/次，加水量10倍。根據回歸分析結果，得效應面圖。見圖2。

2.5 驗證試驗

通過軟件對上述優選工藝進行處理分析，得到試驗預測值為OD=0.895。按優選工藝再進行3次驗證試驗，與預測值的偏差為0.002 7%，偏差較小，表明所選工藝穩定性好，可信度高。見表3。

3 討論

達原飲中檳榔辛散濕邪，化痰破結，使邪速潰，為君藥。檳榔主要成分為檳榔堿，但檳榔堿在高溫下易分解，易溶于水隨著水蒸氣而揮發，達原飲顆粒經水煎煮提取，檳榔堿減少50%以上，且檳榔堿為小分子生物堿，在C18柱上不易保留，不適合作為含量測定指標[12-13]。厚樸芳香化濁，理氣祛濕為臣藥。厚樸酚與和厚樸酚在厚樸中含量較高，性質穩定，國內外研究較多，常作為含量測定指標，故選取之[14-15]。

可以將復雜的未知函數，在小區域內進行一次或二次多項式模型擬合，對實驗考察的各個水平進行連續分析，在一個區域內直觀地反映各因素與響應值之間的關系，找到最優值。而常用的正交試驗是線性模型設計，考察的只是已設定好的水平組合，得到的不一定是最優組合。響應面法常用的有星點設計響應面法和Box-Behnken響應面法，Box-Behnken響應面法適用于3～7因素的實驗設計，實驗次數較星點設計法少，實驗結果不會超出設定水平，實驗結果更能為生產提供依據[16]。雖然在試驗次數上，響應面法比正交試驗法有所增加，但在中藥提取中，涉及的考察因素之間的相互影響，一般都是非線性的，Box-Behnken響應面法得到更理想的實驗結果，且能提供各因素的交互作用影響，為實際生產提供更多的有效信息。

經典名方因歷史悠久，對某些疾病的療效確切，國家政策的扶持等原因，被大量開發研究。但目前的含量考察僅以提取率和主成分含量作為標準，不能很好體現中藥復方制劑的特點。近兩年提出中藥飲片標準湯劑和物質基準的概念，標準湯劑是基于中藥飲片水煎液的質量標準，更符合作為制劑開發的含量考察標準。物質基準目的是保證中藥材、中藥飲片、標準顆粒間的一致性。建立更完善的考察標準，將有利于經典方開發成有臨床價值的制劑[17-18]。

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（2019-04-11收稿 責任編輯：楊覺雄）