芪術抗癌方對肝癌HepG₂細胞增殖和凋亡的影響

馮文杏　周小舟　韓志毅　孫新鋒　馬文峰　張衛

摘要 目的：探討芪術抗癌方對肝癌HepG2細胞增殖與凋亡的調控作用。方法：體外培養HepG2細胞，加入不同濃度芪術抗癌方（0，250，500，1 000 mg/L）處理48 h。采用細胞計數試劑盒8（CCK-8）檢測細胞活力，采用免疫印記法檢測凋亡相關蛋白c-Caspase-3和c-Caspase-9表達變化。結果：CCK-8結果顯示芪術抗癌方可呈濃度依賴性抑制HepG2細胞增殖，與對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05），1 000 mg/L組抑制效果最好，芪術抗癌方刺激HepG2細胞后，凋亡相關蛋白c-Caspase3及c-Caspase9表達增加，呈濃度依賴性，在1 000 mg/L組達到最高且差異有統計學意義（c-Caspase3增加1.83倍，P<0.05;c-Caspase9增加1.06倍，P<0.05）。結論：芪術抗癌方可抑制肝癌HepG2細胞增殖并誘導細胞凋亡。

關鍵詞 芪術抗癌方;肝癌;HepG2細胞;增殖;凋亡;Caspase-3;Caspase-9;機制研究

Abstract Objective：To study the effects of Qizhu Kangai Formula on the proliferation and apoptosis of HepG2 heptoma cells of liver cancer.Methods：The HepG2 cells were cultured in vitro and treated with different concentration of Qizhu Kangai Formula （0，250，500，1 000 mg/L ） for 48 h.The living cells were detected by cell counting kit 8 （ CCK8 ） and the protein expression of c-caspase3 and c-caspase9 were observed by Western-blot.Results：CCK8 showed that Qizhu Kangai Formula could inhibit HepG2 cells proliferation in concentration-dependent manner and had significant differences with the control group （P<0.05）.Among them，the 1000 mg/L group had the best inhibition effects.Further studies found that the expression of the apoptotic proteins c-caspase3 and c-caspase9 increased after the stimulating HepG2 cells by Qizhu Kangai Formula and was concentration-dependent and was highest in the 1000 mg/L group with statistical significance （ c-caspase3 increased 1.83 times，P<0.05; c-caspase9 increases by 1.06 times，P<0.05 ）.Conclusion：Qizhu Kangai Formula could inhibit the proliferation and induce apoptosis of HepG2 heptoma cells.

Keywords Qizhu Kangai Formula ; Liver cancer; HepG2 cells; Proliferation; Apoptosis; Caspase-3; Caspase-9; Mechanism research

中圖分類號：R289.5;R735.7文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.11.015

據流行病學研究顯示，肝癌是世界第6大最常見惡性腫瘤和第2位癌癥相關死亡原因[1-2]，其發病隱匿，很多患者到晚期才診斷，僅僅1/3的新確診患者適合治愈性治療[3]，終晚期患者是不可治療的且大多數生存期為3～6個月[4]，多激酶抑制劑索拉菲尼是美國食品藥品管理局（FDA）唯一批準的系統治療晚期肝癌藥物，可以延長生存期3個月[5]。中醫藥在肝癌綜合治療中顯示了好的療效[6]，能增效減毒。周小舟教授總結多年臨床經驗，基于郭振球教授抗纖靈方的基礎上，創立芪術抗癌方，能明顯提高原發性肝癌患者的生命質量及延長生存期[7]，但具體作用機制尚不明確。本研究采用CCK8法和免疫印跡法探索芪術抗癌方在體外對肝癌HepG2細胞增殖與凋亡調控的作用，從而為其臨床應用提供一些理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人肝癌細胞株HepG2購于武漢博士德公司（批號：20161209）。細胞培養用含10%FBS+1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基培養，置于37 ℃細胞培養箱中（95%濕度，5%CO2）。每1～2天換液1次。細胞生長融合至80%～90%時用0.25%胰蛋白酶（含0.02% EDTA）溶液消化、傳代。

1.1.2 藥物 芪術抗癌方凍干粉，芪術抗癌方（柴胡6 g、白芍10 g、雞內金10 g、莪術10 g、黃芪10 g、炙甘草5 g、炒白術15 g），藥物浸泡1 h，用8倍的蒸餾水煎煮2次，過濾煎液，12 000×g離心2次，每次30 min，取上清液凍干，密封儲存于-20 ℃冰箱（深圳市中醫院制劑科制備）。

芪術抗癌方浸提液制備：無菌離心管中用DMEM培養液充分溶解，0.22 μm微孔濾器過濾，得到濃度為1 000 mg/L的母液，DMEM稀釋分別獲得其他500 mg/L和250 mg/L濃度使用。浸提液均現配現用。

1.1.3 試劑與儀器 超凈工作臺（美國ESCO公司，型號：ACB-4E1）;CO2培養箱（美國Thermo Scientific公司，型號：BBD6220）;全自動凝膠成像和化學發光圖像分析系統（美國Bio-Rad公司，型號：ChemiDoc TMMP）;垂直電泳儀、轉膜儀（美國Bio-Rad公司，型號：1658003）;酶標儀（美國BioTek公司，型號：synergy2）。CCK8檢測試劑盒（日本DojinDo公司，貨號：CK04），c-Caspase-3一抗（英國Bioss，貨號：Bs-0081R）、β-actin一抗（Sigma，貨號：MAB1501）、c-caspase9一抗（英國Abcam公司，貨號：Ab202068）和鼠兔二抗（CST，貨號：7076P2、7074P2）。

1.2 方法

1.2.1 分組 分為對照組和芪術抗癌方濃度分別為250，500，1 000 mg/L組4組。

1.2.2 干預 對照組細胞予以DMEM培養，芪術抗癌方組的細胞予以相應濃度浸提液干預。

1.2.3 檢測指標與方法

CCK8法檢測細胞活性：將指數生長的HepG2按1×106/孔接種在96孔板，置于37 ℃細胞培養箱中（95%濕度，5%CO2），24 h后棄去培養基。按1.2.1和1.2.2分組及干預，每孔200 μL，每組設10個復孔。培養箱中培養48 h后，棄去培養液，每孔加入10 μLCCK8試劑，放入培養箱培養1 h后，用酶標儀測定450 nm波長時各孔A值。

免疫印跡法檢測c-Caspase-3、c-Caspase-9蛋白表達：HepG2細胞分組給藥培養48 h后，吸除培養液，培養皿置于冰上，PBS洗2次，加入1×細胞裂解液120 μL/皿覆蓋均勻，搖床上裂解 10 min。用細胞刮刮下細胞蛋白并移入預冷的1.5 mL EP管中，離心（4 ℃，12 000×g，10 min）后將上清轉入另-1.5 mL EP管。采用Bradford法測蛋白濃度并配平。100 ℃水浴10 min變性，離心后于-80 ℃冰箱保存備用。將等量蛋白進行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜、5%脫脂奶粉室溫封閉60 min、孵對應一抗、二抗曝光顯影、圖像分析。采用Image-Lab軟件（美國Bio-Rad公司）進行電泳條帶灰度值分析，其結果以目的蛋白與內參蛋白（β-actin）灰度值的比值表示。

1.3 統計學方法

采用SPSS 21.0統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間差異進行單因素方差分析，并進行兩兩比較，方差齊時采用LSD檢驗，方差不齊時采用Games-Howell檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 芪術抗癌方對HepG2細胞增殖的影響

抗癌方處理HepG2細胞48 h后，隨著藥物濃度的增加，肝癌細胞成活率逐漸下降。抗癌方對HepG2細胞增殖抑制呈濃度依賴性，濃度升高，抑制效果更加明顯。與對照組比較，250 mg/L、500 mg/L、1 000 mg/L組差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1。

2.2 芪術抗癌方對HepG2凋亡的影響

不同濃度芪術抗癌方刺激HepG2細胞48 h均可增加凋亡相關蛋白c-Caspase-3、c-Caspase-9的表達，且呈藥物濃度依賴性增加。與對照組比較，濃度為1 000 mg/L時c-Caspase-3、c-Caspase-9蛋白表達分別增加1.83倍、1.06倍，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2。

3 討論

周小舟教授認為肝癌的主要病因是正氣不足與外感疫毒相互作用所致，結合現代醫學，即HBV、HCV、過度飲酒等病原因素與機體免疫失調的綜合結果[8]。通過臨床調查發現肝癌的主要證型是氣虛血瘀[9]，針對此病機，芪術抗癌方以扶正祛瘀為原則，方中黃芪、黨參、白術、山藥等健脾益氣，莪術活血化瘀，雞內金軟堅散結，白花蛇舌草清邪毒。全方扶正為主，佐以祛邪，臨床療效顯著。

增殖與凋亡之間的平衡失調是肝癌發生發展的一個潛在因素，通常增殖信號激活而調亡過程抑制，導致肝癌細胞生存，然后增殖[10]，同時增殖凋亡的異常與終晚期肝癌系統治療藥物索拉菲尼的耐藥相關[11]。本研究中CCK8法檢測細胞活性結果顯示芪術抗癌方對HepG2細胞增殖有抑制作用，呈濃度依賴。

細胞凋亡是一種維持機體穩態的程序性死亡，主要分為死亡受體途徑和線粒體途徑。死亡受體途徑是通過死亡配體與細胞表面受體結合的外源性形式激活Caspase-8，繼之激活Caspase-3。線粒體途徑是哺乳動物細胞凋亡的主要途徑，內在信號壓力下線粒體外膜通透性（MOMP）增加，釋放細胞色素C，Caspase-9與活化的APAF1結合形成凋亡復合體后被激活，活化的Caspase-9隨后激活Caspase-3。Caspases本來結構上是不活躍的，需要蛋白水解過程裂解激活，它們可以自我激活或者相互之間發生類似級聯過程，活化的Caspase-3是細胞凋亡的關鍵“劊子手”[12]，許多研究表明誘導凋亡對抑制肝癌的發展有重要意義[13-15]，抗癌方既往研究顯示可以提高凋亡相關基因P53表達[16]。本研究中凋亡相關蛋白c-Caspase-9和c-Caspase-3均隨著藥物濃度的增加表達上調，推測抗癌方對肝癌細胞有促進凋亡的作用，可能是通過激活線粒體途徑實現的。

綜上所述，芪術抗癌方可以抑制肝癌HepG2細胞增殖并誘導其凋亡，而凋亡具體上游觸發機制尚不明確，待進一步研究。

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（2019-03-25收稿 責任編輯：張雄杰）