27nt-miRNA對氧化型低密度脂蛋白誘導的人臍靜脈內皮細胞凋亡的影響*

趙燕姣， 顏淵鴛， 李 丹， 羅雪蘭， 楊 鵬，周福隆， 楊瑞霞， 唐雙意， 歐和生△

（1廣西醫科大學藥學院，廣西南寧530021；2廣西中醫藥大學附屬國際壯醫醫院科技部，廣西南寧530201；3廣西醫科大學第一附屬醫院藥學部，廣西南寧530021）

血管內皮細胞（vascular endothelial cells，VECs）是一層位于血管壁內側的扁平單層細胞。正常生理情況下，VECs 通過調節血流與血管壁之間的物質交換維持著血管內環境穩態；在血管損傷，機械損傷，及氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，Ox-LDL）、活性氧、促炎細胞因子和高水平的一氧化氮（nitric oxide，NO）等生物活性因子的刺激作用下，VECs 的通透性發生改變，導致炎癥細胞入侵和血管壁脂質沉積，從而導致血管壁增厚與管腔狹窄。Ox-LDL 是一種動脈粥樣硬化的促進因子，它可與內皮細胞表面的LOX-1 受體結合以誘發氧化連接反應導致膽固醇沉積，從而引起細胞凋亡［1］。VECs凋亡在動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）等血管生成性疾病的發病機制中發揮著重要作用［2］。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一類含有19～22 個核苷酸（nucleotide，nt）的高度保守的非編碼單鏈小分子 RNA［3］。新近研究顯示，miRNA 逐漸成為血管生成性疾病相關內皮細胞調亡的重要調控因子，如miR126-3p 高表達可以抑制HLMVEC 的增殖、促進其凋亡，使血管生成所阻［4］；miR-106b 可通過調節PTEN 的表達激活PI3K/AKT 通路，促進HAEC 增殖，抑制其凋亡［5］。我們的前期研究證實，來自內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）第4 內含子中的27 堿基重復序列轉錄的RNA（27nt-miRNA，27nt-miR）高表達可顯著抑制人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的增殖、遷移和血管生成，這與27nt-miR 抑制eNOS 的表達/活性及其代謝產物NO的合成與釋放相關［6］。由于NO 不僅是維持血管舒張功能的重要因子，而且參與內皮細胞的增殖、遷移和凋亡的調節［7］，故推測 27nt-miR 可通過對相關凋亡基因的調控，參與VECs增殖、遷移與凋亡的調節。為證實上述推測，本研究通過建立體外Ox-LDL 誘導HUVECs 凋亡模型 ，探 討 27nt-miR 對 Ox-LDL 誘 導HUVECs 凋亡的影響以及作用機制，為AS 等慢性心血管疾病的治療提供參考資料。

材料和方法

1 主要試劑和儀器

HUVECs（Procell）；DMEM培養液（Gibco）；胎牛血清（Lonsera）；慢病毒載體（上海吉凱基因化學技術有限公司）；氧化低密度脂蛋白（廣州奕元生物技術公司）；CCK-8（武漢博士德生物技術公司）；Hoechst 33258 染色試劑盒和caspase-3 活性檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；Annexin V-APC/7-AAD 凋亡檢測試劑盒（杭州聯科生物技術股份有限公司）；TRIzol 試劑盒（Axygen）；逆轉錄試劑盒和SYBR RT-qPCR 試劑盒（TaKaRa）；兔抗 Bcl-2 抗體、兔抗 Bax 抗體、兔抗 caspase-3 抗體、兔抗 GAPDH 抗體及抗兔lgG（H+L）熒光II 抗（Cell Signaling Technology）。實時熒光定量 PCR 儀（Applied Biosystems）；倒置相差熒光顯微鏡（Olympus）。

2 方法

2.1 27 nt-miR 慢病毒載體的構建和鑒定 委托上海吉凱基因化學技術有限公司以27nt-miR 序列（5′-GUCAUCAGUCGAGCUAGACGAG-3′）設計27nt-miR高表達慢病毒載體，然后以其反義序列及陰性對照隨機序列構建anti-27nt-miR 和miR-NC 慢病毒載體。以 Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-Puromycin 為載體，經AgeI/NheI 雙酶切，轉染293T 細胞，濃縮得到目的慢病毒載體。病毒載體上含有綠色熒光蛋白和嘌呤霉素抗性蛋白，可觀察綠色熒光表達并用嘌呤霉素篩選得到穩定細胞株。

2.2 HUVECs 慢病毒質粒轉染和實驗分組 取對數生長期細胞，以細胞密度為5×107/L，按每孔2 mL將細胞懸液接種于6 孔板，孵育過夜至細胞貼壁。上述3 種慢病毒載體以感染指數（multiplicity of infection，MOI）=70 感染HUVECs，置于培養箱中轉染10 h 后更換新鮮完全培養液。參考 Zhang 等［5］的方法，實驗分為5 組：（1）正常對照組；（2）Ox-LDL 組；（3） 27nt-miR+Ox-LDL 組 ；（4） anti-27nt-miR+Ox-LDL 組；（5）miR-NC+Ox-LDL 組。除正常對照組正常培養外，Ox-LDL 組給予40 mg/L Ox-LDL 處理48 h誘導細胞凋亡，其余轉染組細胞均先轉染相應慢病毒質粒繼而給予40 mg/L Ox-LDL 處理48 h 誘導細胞凋亡。

2.3 CCK-8 法檢測 HUVECs 活力 參考蔡爽等［8］的方法，將各組細胞接種到96孔板中，每孔5×103個，每組設置3 個復孔，待細胞貼壁后按設定實驗條件處理，每孔加入110 μL CCK-8 試劑（100 μL 培養液+10 μL CCK-8），避光孵育 1 h 后，酶標儀檢測 450 nm 波長處各組的吸光度（A450），實驗重復3 次。細胞活力（%）=（實驗組A450值-調零組A450值）/（空白組A450值-調零組A450值）×100%。

2.4 劃痕法檢測HUVECs 的遷移能力 參考沈鳳等［9］的方法，將各組細胞接種于 48 孔板中，每孔 3×104個，每組設置3 個復孔，培養細胞至密度100%融合，用吸頭垂直各孔底部中間劃“一”字痕，PBS 沖洗3次，然后加入含40 mg/L Ox-LDL的無血清培養液繼續培養，于顯微鏡下觀察0 h 和24 h 的遷移愈合情況，實驗重復3 次。遷移率（%）=（0 h 劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

2.5 caspase-3 活性試劑盒檢測caspase-3 活性 參考Chen等［10］的方法，取各組細胞接種于6孔板中，每孔2×105個，每組設置3個復孔，培養箱中培養至細胞貼壁后，加入含40 mg/L Ox-LDL 的無血清培養液2 mL 繼續培養48 h。收集并冰浴裂解各組細胞，取上清液 50 μL，加入 40 μL 檢測液和 10 μL Ac-DEVD-pNA，避光孵育2 h，酶標儀檢測405 nm 波長處各組的吸光度（A405），實驗重復3次。

2.6 Hoechst 33258 染色法檢測HUVECs 的凋亡情況 參考李松巖等［11］的方法，取無菌蓋玻片置于6孔板內，將各組細胞以每孔5×104個接種于玻片上，待細胞生長至密度為70%時，每組分別加入40 mg/L的Ox-LDL 刺激48 h，棄去培養液，加入0.5 mL 固定液 10 min。PBS 洗滌 3 次，加入染色液 5 min，PBS 洗滌3 次。將熒光淬滅封片液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片。熒光顯微鏡下隨機拍取5 個不同的視野，計算細胞凋亡率，實驗重復3 次。細胞凋亡率（%）=視野內細胞凋亡數/視野內總細胞數×100%

2.7 流式細胞術檢測各組HUVECs 的凋亡率 參考蔡爽等［8］的方法，取各組細胞接種于6 孔板中，每孔 2×105個，待細胞貼壁后給予 40 mg/L 的 Ox-LDL 處理48 h。收集細胞并清洗。取500 μL上樣緩沖液重懸細胞。每管依次加入5 μL Annexin V-APC 和5 μL 7-AAD，輕柔混勻后，室溫避光孵育15 min，利用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，實驗重復3次。

2.8 RT-qPCR 法檢測 HUVECs 中 Bcl-2、Bax和caspase-3的mRNA表達情況 用Trizol試劑盒提取各組細胞總RNA。委托上海生工生物工程設計、合成目標引物，序列見表1。分別取各組細胞總RNA 1 μg，根據逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA，以cDNA 為模板，按SYBR RT-qPCR 試劑盒說明書加入反應體系，上機檢測。每個樣本重復測定3 次，取平均值，以 GAPDH 為內參照，采用 2-ΔΔCt法進行數據分析。反應條件：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，40 個循環；最后 72℃延伸 5 min，終止反應。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

2.9 Western blot 法 檢測 HUVECs 中 Bcl-2、Bax 和caspase-3 蛋白表達情況 收集并裂解各組細胞，取上清液，BCA 法檢測蛋白濃度。分別取40 μg蛋白進行SDS-PAGE、轉膜，分別加入相應Ⅰ抗稀釋液（稀釋比例1∶1 000），4℃孵育過夜。次日加入熒光Ⅱ抗（稀釋比例1∶10 000）室溫避光孵育1 h。利用LICOR 公司的Odyssey 紅外熒光掃描成像系統分析蛋白電泳條帶灰度值，以GAPDH 為內參照。蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH 灰度值。實驗重復3次。

3 統計學處理

采用SPSS 25.0統計軟件分析實驗數據，數據均以均數±標準差（mean±SD）表示。單因素方差分析用于多組間比較，LSD-t檢驗用于組間兩兩比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 27nt-miR 對 Ox-LDL 誘導的 HUVECs 活力的影響

與正常對照組相比，Ox-LDL 組細胞活力顯著降低（P＜0.05）；與miR-NC+Ox-LDL 組相比，27nt-miR+Ox-LDL 組細胞活力顯著降低（P＜0.05），而anti-27ntmiR+Ox-LDL組細胞活力顯著升高（P＜0.05），見圖1。

Figure 1.27nt-miR inhibited the viability of HUVECs.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal control group；#P＜0.05 vs miR-NC+Ox-LDL group.圖1 27nt-miR抑制HUVECs活力

2 27nt-miR 對 Ox-LDL 誘導的 HUVECs 遷移能力的影響

與正常對照組相比，Ox-LDL 組HUVECs 遷移率降低（P＜0.05）；與 miR-NC+Ox-LDL 組相比，27ntmiR+Ox-LDL 組HUVECs 遷移率顯著降低（P＜0.05），而anti-27nt-miR+Ox-LDL 組HUVECs 遷移率顯著升高（P＜0.05），見圖2。

3 27nt-miR 對 Ox-LDL 誘 導 的 HUVECs 中 cas?pase-3活性的影響

與正常對照組相比，Ox-LDL 組HUVECs 內caspase-3 相對活性升高（P＜0.05）；與miR-NC+Ox-LDL組相比，27nt-miR+Ox-LDL 組 HUVECs 內 caspase-3的相對活性顯著升高（P＜0.05），而anti-27nt-miR+Ox-LDL 組 HUVECs 內 caspase-3 的相對活性顯著降低（P＜0.05），見圖3。

4 27nt-miR對Ox-LDL誘導HUVECs凋亡的影響

Ox-LDL 組HUVECs 的凋亡率顯著高于正常對照組（P＜0.05）；與 miR-NC+Ox-LDL 組相比，27ntmiR+Ox-LDL 組HUVECs 的凋亡率升高（P＜0.05），而anti-27nt-miR+Ox-LDL 組HUVECs 的凋亡率降低（P＜0.05），見圖4。

5 27nt-miR 對 Ox-LDL 誘導的 HUVECs 凋亡率的影響

與正常對照組相比，Ox-LDL 組HUVECs 的凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與miR-NC+Ox-LDL 組相比，27nt-miR+Ox-LDL 組HUVECs 的凋亡率顯著升高（P＜0.05），而anti-27nt-miR+Ox-LDL組HUVECs的凋亡率顯著降低（P＜0.05），見圖5。

6 27nt-miR 對 Bax、caspase-3和Bcl-2 mRNA 表達的影響

與正常對照組相比，Ox-LDL 組Bax 和caspase-3 mRNA 的相對表達量顯著升高（P＜0.05），而 Bcl-2 mRNA 的相對表達量和Bcl-2/Bax 的mRNA 表達比例顯著降低（P＜0.05）；與 miR-NC+Ox-LDL 組相比，27nt-miR+Ox-LDL 組 Bax和caspase-3 mRNA 的 相 對表達量顯著升高（P＜0.05），Bcl-2 mRNA的相對表達量和Bcl-2/Bax 的mRNA 表達比例顯著降低（P＜0.05），而 anti-27nt-miR+Ox-LDL 組 Bax和caspase-3的 mRNA 相對表達量顯著降低（P＜0.05），Bcl-2 mRNA 的相對表達量和Bcl-2/Bax 的mRNA 表達比例顯著升高（P＜0.05），見圖6。

7 27nt-miR 對 Bax、caspase-3和Bcl-2 蛋白表達的影響

Ox-LDL組Bax和caspase-3蛋白表達水平高于正常對照組（P＜0.05），而Bcl-2 蛋白表達水平和Bcl-2/Bax 蛋白表達比例低于正常對照組（P＜0.05）；27ntmiR+Ox-LDL 組 Bax和caspase-3 蛋白表達水平較miR-NC+Ox-LDL 組上調（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達水平和 Bcl-2/Bax 蛋白表達比例下調（P＜0.05）；而anti-27nt-miR+Ox-LDL 組 Bax和caspase-3 蛋 白 表 達水平較 miR-NC+Ox-LDL 組下調（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達水平和Bcl-2/Bax 蛋白表達比例上調（P＜0.05），見圖7。

Figure 2.27nt-miR inhibited the migration of HUVECs.The scale bar=20 μm.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal control group；#P＜0.05 vs miR-NC+Ox-LDL group.圖2 27nt-miR抑制HUVECs的遷移

Figure 3.27nt-miR increased the activity of caspase-3 in the HUVECs.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal control group；#P＜0.05 vs miR-NC+Ox-LDL group圖3 27nt-miR增強HUVECs內caspase-3活性

討 論

本實驗通過研究27nt-miR 對Ox-LDL 誘導的HUVECs 凋亡的影響及相關分子機制，得到結果如下：（1）27nt-miR 可促進Ox-LDL 誘導的內皮細胞凋亡；（2）27nt-miR 促進Ox-LDL 誘導的內皮細胞凋亡的同時，抑制細胞的活力和遷移；（3）27nt-miR 通過促進Ox-LDL誘導的Bax和caspase-3表達上調及Bcl-2表達下調參與細胞凋亡進程。

內皮細胞凋亡可破壞內皮完整性和屏障功能，引起炎性細胞浸潤，脂質轉運和新內膜形成，促進脂質沉積，導致AS等血管疾病的發生發展［12］。Ox-LDL是引發和促進AS 等心血管疾病發生發展的危險因素之一，它可誘導內皮細胞凋亡。研究表明，正常生理條件下，低濃度的Ox-LDL 促進內皮細胞增殖，在維持血管壁環境穩態中起重要作用，而高濃度的Ox-LDL 則可引發內皮細胞凋亡或壞死［1］。研究表明，Ox-LDL 可通過調控PI3K/Akt 信號通路誘導內皮祖細胞凋亡，引起組織缺血和血管形成受損，加重冠狀動脈進程［13］。本實驗中，觀察到使用 Ox-LDL 刺激HUVECs 后細胞的凋亡率顯著上升，細胞活力和遷移率顯著下降，提示Ox-LDL 對HUVECs 具有明顯的凋亡誘導作用。

內皮細胞的異常凋亡、增殖和遷移是AS 等心血管疾病發展中的重要致病事件［14］。miRNA 作為基因轉錄調控分子，通過調節內皮細胞的增殖、遷移和凋亡參與心血管疾病的發生發展［15］。例如，miR-200c-3p 通過結合鋅指結合E-box 的同源盒2，抑制血管緊張素Ⅱ誘導的大鼠腎動脈內皮細胞增殖和遷移，減輕高血壓性腎損傷［16］。miR-345-3p 在 Ox-LDL 誘導的HUVECs 凋亡過程中表達下調，其通過靶向TRAF6抑制Ox-LDL 誘導的細胞凋亡和炎癥反應，減緩 AS 的發展［17］。miR-497 在 AS 模型鼠和 Ox-LDL 誘導HUVECs凋亡過程中均表達上調，其通過調控Bcl-2/Bax-caspase-9-caspase-3 途徑抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，加重AS 炎癥程度［18］。本課題組前期研究表明，27nt-miR 參與調節VECs 的增殖、遷移和管腔形成，并抑制哺乳動物雷帕酶素靶蛋白誘導的VSMCs 凋亡［19］。在本實驗中，我們通過將 27nt-miR高表達與anti-27nt-miR 慢病毒質粒轉染入HUVECs，之后用Ox-LDL刺激HUVECs，結果顯示，27nt-miR 高表達可顯著提高內皮細胞的凋亡率，與此同時內皮細胞的增殖速度與遷移能力顯著降低，而抑制27ntmiR 表達則可以部分緩解Ox-LDL 誘導的細胞凋亡和增殖、遷移抑制。這一結果提示27nt-miR 可促進Ox-LDL 誘導的 HUVECs 凋亡，并且抑制 HUVECs 增殖和遷移。

Figure 4.27nt-miR promoted the apoptosis of HUVECs induced by Ox-LDL.The apoptosis was detected by Hoechst 33258 staining.The scale bar=20 μm.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal control group；#P＜0.05 vs miR-NC+Ox-LDL group.圖4 27nt-miR促進Ox-LDL誘導的HUVECs凋亡

Bcl-2 是一種抗凋亡蛋白，可以通過抑制線粒體細胞色素C的釋放，激活下聯caspase級聯反應，或作為抗氧化劑防止多種刺激誘導的細胞凋亡［20］。Bax是Bcl-2 同源的水溶性相關蛋白，凋亡發生時，Bax從細胞質轉移至線粒體，Bax 蛋白被激活，誘導線粒體膜電位降低，促使線粒體釋放細胞色素C，激活半胱氨酸蛋白酶caspase-9，繼而活化下游效應蛋白caspase-3，從而誘導細胞凋亡［21］。caspase-3作為半胱氨酸蛋白酶家族一員，是細胞凋亡蛋白級聯反應中的下游關鍵蛋白，被認為是凋亡中的關鍵調節因子。因此，caspase-3 活性是凋亡過程主要的指標。本研究結果顯示，27nt-miR 高表達可負調控Bcl-2 蛋白表達水平，促進Bax 和caspase-3 的蛋白表達，增強caspase-3 活性，而抑制27nt-miR 表達則表現出相反的趨勢。因此，我們推測27nt-miR 可能通過調控凋亡相關蛋白 caspase-3、Bax和Bcl-2 的表達，影響 Ox-LDL 誘導內皮細胞凋亡的進程。此外，值得注意的是，多數miRNAs在基因轉錄水平通過抑制翻譯或促進RNA 降解調控靶基因表達，例如miR-338-3p 通過靶向抑制AMBI的mRNA 3'非翻譯區抑制其表達，促進Ox-LDL 誘導的內皮細胞凋亡［22］。因此，本研究進一步通過 qRT-PCR 檢測各組 Bax、caspase-3和Bcl-2的mRNA 改變情況，結果顯示，27nt-miR 高表達顯著促 進 Bax和caspase-3 的 mRNA 表 達 ，而 Bcl-2 的mRNA 表達和Bcl-2/Bax 比例均顯著降低。這提示27nt-miR 在基因轉錄水平參與了 Bax、caspase-3 和Bcl-2 mRNA 的調控，進而影響了 Bax、caspase-3 和Bcl-2 的蛋白表達，最終參與Ox-LDL 誘導內皮細胞凋亡的進程。

Figure 5.27nt-miR promoted the apoptosis of HUVECs induced by Ox-LDL.The apoptosis was detected by flow cytometry.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal control group；#P＜0.05 vs miR-NC+Ox-LDL group.圖5 27nt-miR促進Ox-LDL誘導的HUVECs凋亡

綜上所述，本研究初步明確27nt-miR 可促進Ox-LDL誘導的HUVECs凋亡，并抑制HUVECs的活力和遷移，這與27nt-miR 調控凋亡相關蛋白Bax、caspase-3和Bcl-2表達有關。

Figure 6.27nt-miR up-regulated the mRNA expression levels of Bax and caspase-3 and down-regulated the mRNA expression level of Bcl-2 in the HUVECs.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal control group；#P＜0.05 vs miR-NC+Ox-LDL group.圖6 27nt-miR上調HUVECs中Bax和caspase-3 mRNA表達水平，下調Bcl-2 mRNA表達水平

Figure 7.27nt-miR up-regulated the protein expression levels of Bax and caspase-3 and down-regulated the protein expression level of Bcl-2 in the HUVECs.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal control group；#P＜0.05 vs miR-NC+Ox-LDL group.圖7 27nt-miR上調HUVECs中Bax和caspase-3蛋白表達水平，下調Bcl-2蛋白表達水平