過表達轉錄因子BACH2對人急性淋巴細胞白血病T淋巴細胞活力及凋亡的影響*

王旭穎， 荊明箴， 付 榮， 余 謹， 楊 茹

（武漢血液中心，湖北武漢430030）

急性淋巴細胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是一種常見的兒童血液系統惡性腫瘤，約占兒童惡性腫瘤的 1/8 531，年發病率為 4/10 萬［1］。盡管近年來ALL 患者的生存率得到了顯著提高，但復發仍是導致兒童患病死亡的最常見原因之一［2-3］，成人ALL 的難治與復發更是臨床上難以攻克的問題［4］。化療是治療ALL 的主要方法之一，但化療藥物耐藥的產生，成為限制ALL 患者臨床療效的主要障礙，因此，尋找治療ALL 的相關靶點對ALL 治療新策略的發現具有重要的研究意義［5］。

BTB 與 CNC 同源基因 2（BTB and CNC homology 2，BACH2）是一種具有堿性亮氨酸拉鏈結構的轉錄因子，主要在T 細胞、B 細胞和神經細胞等細胞中表達，參與了淋巴細胞的生成與功能調控過程，與多種免疫相關性疾病的發生與發展有關［6-7］。BACH2 作為轉錄抑制因子，在ALL 患者骨髓中的表達低于正常人骨髓，且BACH2 低表達與白血病細胞的惡性生物學行為及較差的臨床預后相關［8］。但BACH2在急性T 淋巴細胞白血病腫瘤細胞中的研究卻少有報道。本項工作探討BACH2在ALL T 淋巴細胞CCRFCEM 與正常人外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中的表達差異，并檢測BACH2 過表達對CCRF-CEM 細胞活力及凋亡的影響，以期為BACH2 在急性T 淋巴細胞白血病中的研究提供參考資料。

材料和方法

1 材料

人急性淋巴細胞白血病T 淋巴細胞CCRF-CEM購于中國科學院細胞庫。RPMI-1640 培養液購于HyClone；胎牛血清和Opti-MEM 培養基購于Gibco；人全血單個核細胞分離液購于天津市灝洋生物制品科技有限責任公司；Trizol 購于Ambion；反轉錄試劑Oligo（dT）18 Primer、PrimeScript II RTase和Recombinant RNase Inhibitor 購 于 TaKaRa；LipofectamineTM2000 購于 Invitrogen；CCK8 試劑盒、Triton X-100、封閉液和抗熒光淬滅封片液購于Solarbio；Annexin VPE/7-AAD 凋亡檢測試劑盒購于BD；抗BACH2 抗體（用于免疫熒光檢測）購于Abcam；細胞周期蛋白D3（cyclin D3）抗體（用于免疫熒光檢測）購于武漢三鷹生物有限公司；抗cyclin D3 抗體、抗Bcl-2 抗體及抗caspase-3 抗體（用于 Western blot 檢測）購于 Bioswamp。

2 方法

2.1 細胞分離和培養 取3 mL 人全血單個核細胞分離液于15 mL離心管中，加入3 mL正常人外周血，500×g離心25 min，離心管中液體分為4層：第1層為血漿層，第2 層為環狀乳白色單個核細胞層，第3 層為透明分離液層，第4 層為紅細胞層。小心吸取第2層于新的離心管中，加入10 mL清洗液，混勻，250×g離心10 min，棄上清，再加入5 mL清洗液重懸細胞沉淀，250×g離心 10 min，加入 5 mL 清洗液重復離心 1次。棄上清液，即可獲得原代PBMC。CCRF-CEM 細胞從液氮罐中取出后，解凍復蘇培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中。

2.2 qPCR 檢測細胞中 BACH2 的 mRNA 表達 采用Trizol試劑提取細胞總RNA，加入反應體系進行反轉錄。采用Primer Premier 5.0 軟件進行引物設計，由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成引物。以逆轉錄獲得的cDNA 為模板進行PCR 擴增，反應程序為：95℃變性5 s，56℃退火10 s，72℃延伸25 s，共39 個循環。BACH2 的上游引物序列為5'-GGTGTGTGAGAAAGAGAAAC-3'，下游引物序列為5'-CAGGGCAATACCGATG-3'；β-actin的上游引物序列為5'-ACACTGTGCCCATCTACG-3'，下游引物序列為5'-TGTCACGCACGATTTCC-3'。 以 β -actin 為 內 參照，采用 2-ΔΔCt法計算細胞中 BACH2 mRNA 的相對表達量。

2.3 實驗分組及處理 將CCRF-CEM 細胞分為：對照（control）組 、空 載 體（empty vector，EV）組 和BACH2 過 表 達（BACH2 over-expression，overExp BACH2）組。對照組細胞不作處理，正常培養；BACH2過表達組采用LipofectamineTM2000將BACH2過表達重組質粒轉染細胞，根據BACH2基因序列（GI：1519315636）設計合成過表達引物，獲得目的片段后，重組至p-EGFP-N1 載體中，獲得重組質粒。采用LipofectamineTM2000 將重組質粒轉染進入CCRFCEM 細胞中，轉染前將細胞接種于24 孔板中，每孔約 5×105個細胞，采用 Opti-MEM 培養基稀釋質粒DNA 和LipofectamineTM2000，然后將轉染試劑與質粒DNA 稀釋液混勻，室溫靜置20 min。將轉染混合液加入細胞培養板中，輕輕搖晃混勻后繼續培養；空載體組細胞轉染空載體。培養24 h后，采用qPCR 檢測細胞中BACH2的mRNA表達水平。

2.4 CCK8 法檢測細胞活力 轉染后，調整細胞密度接種于 96 孔板中，每孔180 μL，約5×103個細胞。培養 24 h，取出培養板，每孔加入20 μL CCK8 溶液，繼續培養4 h。酶標儀檢測各孔在450 nm 處的吸光度（A）值。

2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 取各組細胞懸液，1 000×g離心5 min，棄上清，加入1 mL PBS 液重懸細胞沉淀。1 000×g離心5 min，棄上清，加入100 μL 結合緩沖液懸浮細胞，再分別加入5 μL Annexin V-PE和7-AAD 染液，混勻，避光孵育15 min。加入400 μL 結合緩沖液，進行流式細胞儀上機檢測。

2.6 免疫熒光染色檢測細胞中BACH2 和cyclin D3的表達 取各組細胞懸液，PBS清洗2次，采用4%多聚甲醛于室溫下固定30 min，PBS 洗滌后加入0.5%Triton X-100室溫通透20 min，PBS洗3次。室溫下封閉 1 h 后，加入兔抗 BACH2和cyclin D3 抗體于濕盒內，4℃孵育過夜。PBS 洗3 次，加入II 抗，37℃孵育1 h。PBS 洗 5 次，加入 100 μL 抗熒光淬滅封片液進行染色，滴1滴于載玻片上進行封片，于顯微鏡下觀察。

2.7 Western blot 檢測細胞中 cyclin D3、Bcl-2 及 caspase-3 的蛋白表達 收集對照組、空載體組和BACH2 過表達組細胞，按照每1×106個細胞加入200 μL 裂解液的比例加入裂解液，于4℃充分裂解。將細胞收集于離心管中，95℃加熱10 min，12 000×g離心10 min，取上清液進行蛋白定量。以每孔20 μg 蛋白上樣量進行SDS-PAGE，將蛋白轉移至PVDF 膜上，采用5%脫脂奶粉封閉液4℃封閉過夜。分別加入抗cyclin D3、Bcl-2 和caspase-3 抗體（稀釋比例為1∶1 000），室溫下孵育2 h，PBST清洗3次，加入II抗，室溫下孵育2 h，PBST 清洗3 次。加入化學發光試劑，采用全自動發光分析儀讀取條帶灰度值，計算蛋白的相對表達量。

3 統計學處理

計量資料采用均數±標準差（mean±SD）表示，采用SPSS 23.0統計軟件進行統計分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 BACH2在CCRF-CEM細胞中的表達

檢測人急性淋巴細胞白血病T 淋巴細胞CCRFCEM 和正常人外周血單個核細胞中BACH2基因的mRNA 表達水平，結果顯示，CCRF-CEM 細胞中BACH2 的 mRNA 水平顯著低于 PBMC（P＜0.05），見圖1。

2 BACH2過表達載體轉染效率的檢測

與對照組比較，空載體組細胞中BACH2 的mRNA 表達水平無顯著差異（P＞0.05），而BACH2 過表達組細胞中BACH2 的mRNA 相對表達量顯著升高（P＜0.05），見圖2，說明本次轉染實驗成功獲得BACH2高表達的CCRF-CEM細胞。

Figure 1.The mRNA expression of BACH2 in PBMC and CCRF-CEM cells was detected by qPCR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs PBMC group.圖 1 qPCR 檢測 PBMC和CCRF-CEM 細 胞 中 BACH2 的mRNA表達水平

Figure 2.The mRNA expression of BACH2 in CCRF-CEM cells was detected by qPCR.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group.圖2 qPCR檢測CCRF-CEM 細胞中BACH2的mRNA表達水平

3 BACH2過表達對CCRF-CEM細胞活力的影響

采用CCK8 實驗檢測CCRF-CEM 細胞活力的變化，與對照組比較，空載體組細胞活力無顯著變化（P＞0.05），而 BACH2 過表達組細胞活力顯著降低（P＜0.05），見圖3。

Figure 3.The viability of CCRF-CEM cells was detected by CCK8 assay.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group.圖3 CCK8法檢測CCRF-CEM細胞活力

4 BACH2過表達對CCRF-CEM細胞凋亡的影響

檢測各組CCRF-CEM 細胞的凋亡水平，與對照組比較，空載體組細胞凋亡率無顯著變化（P＞0.05），BACH2 過表達組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），見圖4。

Figure 4.Apoptosis rate of CCRF-CEM cells was detected by flow cytometry.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group.圖4 流式細胞術檢測CCRF-CEM細胞的凋亡率

5 CCRF-CEM 細胞中 BACH2和cyclin D3 表達的變化

免疫熒光染色檢測各組CCRF-CEM 細胞中BACH2 和cyclin D3 的表達水平，結果顯示，與對照組相比，BACH2 過表達組細胞中BACH2 表達增多，見圖5A，而cyclinD3表達減少，見圖5B。

Figure 5.The expression levels of BACH2（A）and cyclin D3（B）in CCRF-CEM cells were detected by immunofluorescence.圖5 免疫熒光染色檢測CCRF-CEM細胞中BACH2和cyclin D3的表達

6 BACH2 過表達對 CCRF-CEM 細胞 cyclin D3、Bcl-2和caspase-3蛋白表達的影響

Western blot 檢測各組CCRF-CEM 細胞中cyclin D3、Bcl-2和caspase-3蛋白表達水平，結果顯示，與對照組相比，BACH2 過表達組細胞中cyclin D3 和Bcl-2 蛋白表達水平降低，而caspase-3 表達升高（P＜0.05），見圖6。

Figure 6.The protein expression levels of cyclin D3，Bcl-2 and caspase-3 in CCRF-CEM cells were detected by Western blot.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group.圖6 Western blot檢測CCRF-CEM細胞中cyclin D3、Bcl-2和caspase-3蛋白表達水平

討 論

ALL 主要表現為T、B 淋巴細胞異常增殖，大量未成熟的白細胞聚集浸潤骨髓及其他組織和器官，引起骨髓的造血功能發生異常和免疫功能紊亂等［9］。成人ALL 主要以兒科治療為基礎強化化療，但隨著年齡的增長，對高強度化療的耐受性降低，不良預后因素的發生率增加［10］，復發/難治性 ALL 急需新的治療方法［11］。由于ALL 具有高度異質性，新分子治療靶點的開發對ALL 患者的臨床治療及預后的改善具有重大意義［12］。

BACH2 是BTB 堿性區亮氨酸拉鏈因子家族的成員之一，Sasaki 等［13］研究表明 BACH2 對 B 淋巴細胞的發育具有調控作用，BACH2基因的缺失是人類B 細胞淋巴瘤常見的染色體改變之一。BACH2 可通過多步驟調節免疫相關疾病，參與B淋巴細胞和T淋巴細胞的發育，調控淋巴細胞的周期［14］。同時，BACH2被認為是T 淋巴細胞維持免疫穩定狀態的調節因子［15］。本研究顯示，ALL T 淋巴細胞中 BACH2的表達顯著低于正常人外周血單個核細胞，該結果與 Ge 等［8］研究結果相似，為了進一步探討 BACH2 在ALL T 淋巴細胞中的具體作用機制，我們通過上調BACH2 在CCRF-CEM 細胞中的表達，觀察過表達BACH2對CCRF-CEM細胞活力和凋亡的影響。

細胞周期的失調在腫瘤的發展過程中發揮關鍵性作用，cyclin D3 是細胞周期轉換的重要正調控因子，染色質免疫沉淀實驗發現BACH2可直接調控cyclin D3，進而調控淋巴細胞周期轉換［14］。破壞細胞活力和凋亡之間的生理平衡是腫瘤發展的重要步驟之一，細胞凋亡抵抗是血液系統惡性腫瘤的關鍵機制［16］。Bcl-2 家族在細胞內源性凋亡通路中發揮重要作用，Bcl-2 家族蛋白可調控線粒體膜電位及通透性，當線粒體內細胞色素C 釋放至細胞質時，可激活caspase 凋亡級聯反應，而caspase-3 則為凋亡執行因子［17-18］。本研究結果顯示，BACH2 過表達抑制了CCRF-CEM 細胞的活力，促進其發生凋亡，且細胞中cyclin D3和Bcl-2 蛋白表達下調，而 caspase-3 表達上調，提示BACH2 通過參與細胞內源性凋亡途徑誘導CCRF-CEM 細胞凋亡。研究顯示［19］，Bcl-2 在淋巴細胞白血病中表達上調，針對Bcl-2 拮抗劑的研發成為治療白血病的方向之一，而本文中過表達BACH2 可下調Bcl-2 表達，因此，BACH2 可能具有治療白血病的潛在價值。

綜上所述，急性T 淋巴細胞白血病細胞中BACH2表達水平降低，上調BACH2表達可抑制白血病細胞的活力，并誘導其凋亡。