lncRNA TTN-AS1通過miR-519d-3p/MMP2調控肺腺癌A549細胞的活力和侵襲

劉 華， 張素蘭， 梁天嵩， 王 娟， 趙靜宜， 鄭穎娟， 張相嫻 ， 楊道科△

（1鄭州大學基礎醫學院，河南鄭州450001，2鄭州大學第一附屬醫院腫瘤醫院，河南鄭州450052）

肺癌是發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類生命和健康。肺腺癌又是最常見的肺癌類型，雖然目前臨床對其治療取得一定的進展，然而其總體預后并不盡如人意［1］。

長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類不編碼蛋白質的非編碼RNA 分子，屬于非編碼RNA 的一員，其轉錄本大于200 nt。lncRNA 可以通過轉錄或轉錄后水平基因調控，抑制或沉默蛋白表達，參與生理和病理過程。目前很多研究表明lncRNA 在腫瘤發生發展中發揮重要作用，參與細胞增殖、周期、遷移、侵襲和凋亡等［2-3］。已有研究顯示，lncRNA TTN 反義RNA 1（TTN antisense RNA 1，TTN-AS1）在乳腺癌、結直腸癌、食管癌、胃癌、前列腺、肺癌等多種腫瘤組織中呈現異常高表達，發揮癌基因的作用［4-7］。基于課題組前期工作的基礎和生物信息學分析結果，提示TTN-AS1 可能通過 微 小 RNA-519d-3p （microRNA-519d-3p，miR-519d-3p）/基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）調控肺腺癌細胞的活力和侵襲。

因此，本研究通過檢測肺腺癌組織中TTN-AS1的表達水平，觀察沉默TTN-AS1 表達對人肺腺癌A549 細胞活力和侵襲的作用，探討TTN-AS1 通過miR-519d-3p/MMP2 調控A549 細胞活力和侵襲的機制。

材料和方法

1 主要材料

人肺癌 A549、H299和H1975 細胞，人正常支氣管上皮細胞BEAS-2B 及人胚腎293T 細胞購自中科院上海細胞庫；Trizol和LipofectamineTM2000購于Invitrogen；胎牛血清和DMEM 培養液購于Gibco；miR-519d-3p mimic、miR-NC、si-lncRNA TTN-AS1 （silncRNA）和si-NC 由上海吉瑪公司合成；報告基因載體pmirGLO 和雙螢光素酶檢測試劑盒購于Promega；Magna RNA 免 疫 沉 淀（RNA immunoprecipitation，RIP）試劑盒購于Millipore；抗MMP2 抗體、抗GAPDH抗體和酶標II 抗購于Abcam；BCA 蛋白檢測試劑盒購于碧云天生物技術研究所；PCR 引物由北京擎科新業生物技術有限公司合成。7500 Fast 熒光定量PCR儀為ABI公司產品。

2 方法

2.1 標本采集 收集 2017 年 10 月～2018 年 12 月鄭州大學第一附屬醫院32 例肺腺癌患者手術切除標本，均經病理證實為肺腺癌。患者年齡46～72 歲（56.26±4.72）。所有患者術前未接受放化療或生物治療，標本置于-196℃液氮保存。該研究經過鄭州大學倫理委員會批準。

2.2 細胞培養和轉染 A549、H299、H1975、BEAS-2B 和293T 細胞均用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM 培養液于 37℃、5% CO2培養。使用 LipofectamineTM2000 轉染細胞，分為3 組：空白（blank）組（未轉染的A549 細胞）、si-NC 組和si-lncRNA 組，每組均設5個重復。

2.3 RNA 提取和RT-qPCR 采用Trizol提取培養細胞和液氮研磨后的組織細胞中的總RNA。lncRNA使用通用引物逆轉錄，miR-519d-3p使用特異莖環引物逆轉錄。熒光定量PCR 擴增，相對表達水平以2-ΔΔCt表示；分別以 GAPDH 和U6為內參照。TTN-AS1的上游引物序列為5'-GCCAGGTAGAGTTGCAGGTT-3'，下游引物序列為5'-GAAGCTGCTGCGGATGAATG-3'；GAPDH 的上游引物序列為5'-GTCACCTTCACCGTTCCAGTTTT-3'，下游引物序列為5'-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTT-3'；miR-519d-3p 的上游引物序列為 5'-TGCGGCAAAGTGCCTCCCTTTAG-3'，下游引物序列為5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6 的上游引物序列為5'-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3'，下游引物序列為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

2.4 CCK8 實驗 實驗在96 孔細胞培養板中進行，各組細胞在培養的0、24、48 和72 h 進行測定。每孔加入10 μL CCK8 溶液，37℃孵育2 h，酶標儀450 nm測定各組細胞的吸光度（A）值，每組設置5個復孔［8］。

2.5 Transwell 實驗 取 100 μL（含有 1×104個細胞）無胎牛血清培養液，接種于制備基質膠的Transwell 上室；下室加入250 μL 含胎牛血清的培養液，在37℃、5%CO2培養箱中常規培養24 h。取出小室，PBS 洗2 遍，多聚甲醇固定后結晶紫染色，顯微鏡下觀察、計數穿膜細胞數，每組設置5個重復。

2.6 雙螢光素酶報告基因實驗 采用PCR 和overlap PCR 分別擴增包含野生型和突變型miR-519d-3p結合位點的TTN-AS1 片段，重組入pmirGLO 報告基因載體，得到野生型和突變型報告基因載體pmir-GLO-WT-TTN-AS1和pmirGLO-Mut-TTN-AS1。同樣方法構建MMP23'UTR 的野生型和突變型報告基因載體 pmirGLO-WT-MMP2 UTR（WT-UTR）和 pmir-GLO-Mut-MMP2 UTR（Mut-UTR）。將野生型/突變型載體分別與miR-519d-3p mimic/miR-NC 共轉染293T細胞，轉染48 h，按照試劑盒說明書檢測螢光素酶活性［9］。

2.7 Western blot 實驗 RIPA 裂解細胞提取總蛋白，BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，SDS-PAGE 分離蛋白，半干轉移法轉至PVDF膜，脫脂奶粉封閉后，加入Ⅰ抗4℃孵育過夜；TBST 清洗，加入酶標Ⅱ抗孵育2 h，最后加入ECL 化學發光液置于凝膠成像系統中采集圖像。

2.8 RIP 實驗 使用Magna RIP 試劑盒（Millipore），按照說明書進行。收集A549 細胞，用RIP 裂解緩沖液裂解細胞；然后使用抗包覆抗人Ago2 抗體磁珠進行Ago2 免疫沉淀，同時使用IgG 抗體作為陰性對照。然后分離免疫沉淀RNA，RT-qPCR 檢測結合部分中TTN-AS1和miR-519d-3p的豐度［10］。

3 統計學處理

用SPSS 24.0 軟件對數據進行統計分析。計量數據以均數±標準差（mean±SD）表示，多組間均數比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

結 果

1 肺腺癌組織中TTN-AS1異常高水平表達

RT-qPCR 結果顯示，32 例肺腺癌組織中TTNAS1 表達水平顯著高于癌旁正常組織（P＜0.05），見圖1A；與癌旁正常組織相比，腫瘤組織中miR-519d-3p 表達水平顯著降低（P＜0.05），而MMP2 mRNA 表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖1B、C。3 個肺癌細胞株A549、H299和H1975的TTN-AS1表達水平都顯著高于人正常支氣管上皮細胞BEAS-2B（P＜0.05），見圖1D；這些肺癌細胞株miR-519d-3p 表達水平顯著降低（P＜0.05），而MMP2 mRNA 表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖1E、F。

Figure 1.The expression of TTN-AS1（A，D），miR-519d-3p（B，E）and MMP2 mRNA（C，F）in lung adenocarcinoma tissues（A～C；n=32）and cell lines（D～F；n=5）detected by RT-qPCR.Mean±SD.*P＜0.05 vs normal group；△P＜0.05 vs BEAS-2B group.圖1 肺腺癌組織和細胞株中TTN-AS1、miR-519d-3p和MMP2 mRNA的表達

2 沉默TTN-AS1 表達可抑制A549 細胞的活力和侵襲

轉染 si-lncRNA 的 A549 細胞 中 TTN-AS1 表達水平與 si-NC 組比較顯著降低（P＜0.05），見圖 2A。CCK8 結果顯示，si-lncRNA 組細胞在 24、48和72 h時的A值均顯著低于 blank 組（P＜0.05），見圖 2B。Transwell 實驗結果顯示，si-lncRNA 組的穿膜細胞數 顯著低于blank組和si-NC組（P＜0.05），見圖2C。

Figure 2.The effect of TTN-AS1 expression knock-down on the viability and invasion of A549 cells.A：the expression of TTN-AS1 in the A549 cells after transfected with si-lncRNA；B：the effect of TTN-AS1 expression knock-down on the viability of A549 cells detected by CCK8 assay；C：the effect of TTN-AS1 expression knock-down on the invasion of A549 cells（scale bar=50 μm）.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs blank group；△P＜0.05 vs si-NC group..圖2 沉默TTN-AS1表達對A549細胞活力和侵襲的影響

3 TTN-AS1負調控miR-519d-3p的表達

生物信息學分析TTN-AS1 與miR-519d-3p 存在吸附位點，見圖3A。雙螢光素酶報告基因實驗結果顯示，miR-519d-3p mimic 與野生型pmirGLO-WTTTN-AS1 共轉染組細胞螢光素酶活性比其他對照組顯著降低（P＜0.05），見圖3B。RT-qPCR 結果顯示，沉默TTN-AS1 表達的細胞中miR-519d-3p 表達水平與對照組相比顯著升高（P＜0.05），見圖3C。RIP 實驗結果顯示，A549 細胞中TTN-AS1 和miR-519d-3p在Ago2 免疫沉淀復合物中的含量顯著高于IgG 免疫沉淀復合物（P＜0.05），見圖3D。

Figure 3.TTN-AS1 negatively regulated miR-204-3p expression.A：the predicted binding sites between miR-519d-3p and TTNAS1；B：dual-luciferase reporter assay；C：the effect of TTN-AS1 silencing on the expression of miR-519d-3p in A549 cells；D：anti-Ago2 RIP was performed in HEK293T cells，followed by RT-qPCR to detect the expression of TTN-AS1 or miR-519d-3p associated with Ago2.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs si-NC group；#P＜0.05 vs WT-TTN+miR-NC group；△P＜0.05 vs anti-IgG group.圖3 TTN-AS1負調控miR-519d-3p的表達

4 miR-519d-3p inhibitor 減弱 沉默 TTN-AS1 對細胞增殖和侵襲的抑制作用

為了證實TTN-AS1 通過miR-519d-3p 對細胞活力和侵襲發揮作用，我們將miR-519d-3p inhibitor（miR inhibitor）和 si-lncRNA 共轉染入 A549 細胞，采用CCK8 和Transwell 實驗觀察其作用。CCK8 和Transwell 結果顯示，si-lncRNA+miR inhibitor 組與 silncRNA 組比，細胞活力顯著增強（P＜0.05），穿膜細胞數顯著增多（P＜0.05），見圖4。

Figure 4.miR-519d-3p inhibitor attenuated the inhibitory effect of TTN-AS1 on the viability and invasion of A549 cells.A：CCK8 assay was used to evaluated the viability of A549 cells；B：Transwell assay was used to evaluated the invasion of A549 cells（scale bar=50 μm）.Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs si-lncRNA group.圖4 miR-519d-3p inhibitor減弱沉默TTN-AS1對細胞活力和侵襲的抑制作用

5 MMP2是miR-519d-3p的靶基因

通過miRbase網站預測，MMP2的3'UTR存在與miR-519d-3p 結合的種子區（seed region），見圖5A。雙螢光素酶報告基因實驗結果顯示，miR-519d-3p mimic 與WT-UTR 共轉染組細胞螢光素酶活性比其他對照組顯著降低（P＜0.05），見圖5B。Western blot結果顯示，與blank 組和miR-NC 組相比，轉染miR-519d-3p mimic 的細胞中MMP2 蛋白表達量顯著降低，見圖5C。

Figure 5. MMP2 was the target gene of miR-519d-3p.A：miR-519d-3p and its putative binding sequences in the 3'UTR of MMP2；B：dual-luciferase reporter assay；C：miR-519d-3p overexpression reduced the protein expression of MMP2.Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs WT-UTR+miR-NC group.圖5 MMP2是miR-519d-3p的靶基因

6 過表達MMP2減弱沉默TTN-AS1表達和過表達miR-519d-3p對A549細胞侵襲的抑制作用

為了進一步證實TTN-AS1 通過miR-519d-3p/MMP2 影響A549 細胞的侵襲能力，我們進行了過表達MMP2 的回復實驗，結果顯示，pcDNA3.1-MMP2與si-lncRNA 或miR-519d-3p mimic 共轉染后的穿膜細胞數比單獨轉染si-lncRNA 或miR-519d-3p mimic均顯著增加（P＜0.05），見圖6。

Figure 6.Rescure experiment of overexpression of MMP2.The invasion of A549 cells was determined by Transwell assay（scale bar=50 μm）.Overexpression of MMP2 attenuated the inhibitory effect of TTN-AS1 silencing or miR-519d-3p overexpression on invasion of A549 cells.Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs si-lncRNA group；#P＜0.05 vs miR-519d-3p group.圖6 過表達MMP2的回復實驗

討 論

Zhong 等［7］研究顯示在肺腺癌組織中 TTN-AS1不僅高表達，且其表達水平與TNM 分期和生存期相關，TTN-AS1 表達水平與TNM 分期正相關，與生存期負相關。本研究結果顯示，32 例肺腺癌組織中TTN-AS1表達水平顯著高于癌旁正常組織；并且3個肺癌細胞株A549、H299和H1975的TTN-AS1表達水平也都顯著高于人正常支氣管上皮細胞BEAS-2B。這個結果再次證實了肺腺癌組織中TTN-AS1 呈現異常高表達的現象，提示TTN-AS1 有可能成為肺腺癌的潛在輔助標志物。

TTN-AS1 位于 2 號染色體，長度 1 077 bp，它能通過海綿吸附的方式調控多種microRNA，從而影響腫瘤的生物學過程。Zhu 等［6］報道 TTN-AS1 通過吸附miR-1271 影響前列腺癌細胞的增殖和侵襲；Wang 等［5］和 Li 等［11］分別 報 道 TTN-AS1 通 過吸 附miR-376a-3p 促進結直腸癌和骨肉瘤細胞增殖和侵襲能力；Jia 等［12］和 Zhong 等［7］分別報道它可以吸附miR-142-5p 和miR-4677-3p 促進肺腺癌細胞的侵襲和上皮-間充質轉化。本研究通過雙螢光素酶報告基因實驗和RIP 實驗證實TTN-AS1 能夠與miR-519d-3p通過預測的吸附位點吸附結合；RT-qPCR檢測沉默 TTN-AS1 表達對 A549 細胞中 miR-519d-3p 表達水平的影響，進一步證實在肺腺癌細胞中TTNAS1 可以通過海綿吸附的方式負調控miR-519d-3p的表達。這個海綿吸附調控通路尚未見有報道，與已報道的TTN-AS1 對microRNA 的吸附位點相比，TTN-AS1 與miR-519d-3p 吸附位點的互補堿基數達到8（圖3A），是已報道結合位點中互補堿基數最多的，這可能是其調控作用較強的一個重要原因。

本研究通過生物信息學預測、雙螢光素酶報告基因實驗和Western blot 實驗證實MMP2是miR-519d-3p 下游靶基因，miR-519d-3p 可以與MMP2 的3'UTR 結合，負調控其表達。MMP2是參與細胞侵襲和遷移的重要一員［13］，為了進一步證實TTN-AS1 通過miR-519d-3p/MMP2 影響A549 細胞的侵襲能力，我們進行了Transwell 的實驗，結果顯示miR-519d-3p inhibitor 可回復沉默TTN-AS1 對細胞侵襲的抑制作用，提示沉默TTN-AS1對細胞侵襲的抑制作用，需通過miR-519d-3p；過表達MMP2 可以部分回復TTNAS1和miR-519d-3p 對 A549 細胞侵襲的作用，提示TTN-AS1和miR-519d-3p 對 A549 細胞侵襲的作用，都需通過MMP2。這說明肺腺癌細胞中也存在不同于 Jia 等［12］和 Zhong 等［7］描述的 TTN-AS1 調控通路，即TTN-AS1 通過miR-519d-3p/MMP2 調控細胞侵襲能力的通路。

綜上所述，本研究提示肺腺癌組織中lncRNA TTN-AS1呈現異常表達情況，可能通過miR-519d-3p/MMP2參與細胞的侵襲過程。