梔子苷通過抑制TLR4/NF-κB信號通路減輕睡眠剝奪大鼠認知功能障礙*

賴根祥， 朱桂東， 何慧明

（1麗水市第二人民醫院精神科，2麗水學院醫學與健康學院科研辦，浙江麗水323000）

睡眠剝奪是指機體因各種因素導致部分或全部正常睡眠量喪失的狀態，睡眠剝奪可通過改變認知、感覺、精神活動等嚴重影響患者心理及生理健康。我國約80%疾病與睡眠質量障礙有關［1-3］。因此，研究睡眠剝奪對機體的影響機制及防治措施已成為近來研究熱點之一。研究表明，認知功能障礙與海馬炎癥有關，Toll 樣受體4/核因子κB（Toll-like receptor-4/nuclear factor-κB，TLR4/NF-κB）信號通路激活可參與細胞免疫應答、炎癥反應及抗凋亡相關基因轉錄，與海馬級聯炎癥反應密切相關［4］。梔子苷（geniposide，Gen）是從茜草科植物梔子干燥果實中提取的活性物質，具有抗炎、抗氧化、清熱利濕、瀉火除煩、涼血解毒和降血糖等多種藥理活性［5-6］。有研究報道Gen 可通過抑制NF-κB p65 通路抑制炎癥反應減輕腦損傷［7］，從而改善糖尿病大鼠的認知功能障礙［8］，但目前尚未發現有關于Gen改善睡眠剝奪大鼠認知障礙及機制的研究，因此，本研究建立完全睡眠剝奪大鼠模型，探討Gen 對其認知障礙的影響及可能作用機制，以期為睡眠障礙患者的治療提供新思路。

材料和方法

1 實驗動物

8 周齡雄性清潔級Wistar 大鼠120 只，體質量210～230 g，購自揚州大學，動物生產許可證號為SCXK（蘇）2018-0005。于本院實驗動物房自由飲水、采食，室溫23～25℃，12 h/12 h 光照、黑暗交替，適應性飼養1周。本研究經過倫理學認證。

2 主要試劑和儀器

梔子苷購自北京索寶萊生物科技有限公司；大鼠S100B ELISA 試劑盒、大鼠神經元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）ELISA 試劑盒、大鼠白細胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA 試劑盒、大鼠IL-6 ELISA 試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）ELISA 試劑盒、兔源TLR4 Ⅰ抗、NF-κB p65 Ⅰ抗、GAPDH Ⅰ抗和山羊抗兔IgGⅡ抗均購自Abcam。MODEL550 型酶標儀購自Thermo；Morris 水迷宮實驗裝置購自上海吉量軟件科技有限公司；電泳儀購自Bio-Rad等。

3 方法

3.1 動物分組及睡眠剝奪模型的建立 120 只Wistar 大鼠隨機分為正常對照（normal control，NC）組、模型（model，M）組、Gen 低劑量（low-dose Gen，Gen-L）組、Gen 中劑量（middle-dose Gen，Gen-M）組、Gen高劑量（high-dose Gen，Gen-H）組及 Gen-H+LPS（TLR4通路激活劑）組，每組20只。動物行為學實驗結束后，考慮到后續實驗方法、取材樣本量和取材部位等問題，采用隨機數字表法對每組20 只大鼠進行隨機分組，每組5 只，分別用來進行HE 染色、RT-qPCR檢測、Western blot檢測和ELISA檢測。

Gen-L、Gen-M和Gen-H 組分別給予 Gen 5 g/kg、10 g/kg和20 g/kg［8］灌胃，Gen-H+LPS 組大鼠每天尾靜脈注射 0.4 mg/kg LPS（持續 7 d）激活 TLR4 通路［9］后給予Gen 20 g/kg 灌胃，NC 組和M 組給予等量生理鹽水，每天灌胃1次，持續7 d。之后，M組、Gen-L組、Gen-M組和Gen-H組、Gen-H+LPS組采用改良小平臺水環境法制備大鼠剝奪睡眠模型［10］，制作30 cm×30 cm×30 cm 睡眠剝奪箱，中間放置直徑7 cm，高8 cm圓形平臺，平臺周圍注滿水，水位低于平臺1 cm，大鼠可在平臺上自由飲水、采食，每天換水1 次，若其睡眠，則因肌肉松弛垂頭觸水而醒，大鼠只能重振精神爬上平臺，這樣反復多次達到剝奪睡眠的效果，進行72 h連續睡眠剝奪。

3.2 Morris 水迷宮實驗 造模成功后，將各組15 只大鼠進行Morris 水迷宮適應性訓練，水迷宮由黑色水池組成，水池為直徑1.5 m 圓柱形，高50 cm。池內放有直徑10 cm 的可移動實心平臺隱藏于第一象限中間隔板下2 cm，水溫保持19～21℃。將大鼠分別從各個象限面朝池壁放入水中，每天4 次，每次120 s，連續訓練4 d，120 s 內找到平臺的大鼠，找到平臺時自動停止記錄時間，讓大鼠停留在平臺上20 s；120 s 內仍未找到平臺的大鼠，用導向桿將大鼠將引導至平臺，時間記為120 s。檢測實驗：第5天拆除平臺，從原放置平臺對角方向將大鼠面朝池壁放入水中，計算并跟蹤大鼠爬至平臺上或達到預先設置的訓練時長及計算大鼠尋找平臺耗費的時間（即逃避潛伏期）；若最終大鼠仍未找到平臺，則逃避潛伏期記為60 s，重復4次求平均值。

3.3 Y 迷宮實驗 Y 迷宮制作材質為聚氯乙烯板，呈“Y”形，將黑色膠紙貼于迷宮內外壁。迷宮分別由3 個臂隔離分為Ⅰ區、Ⅱ區和Ⅲ區3 個工作區，臂尺寸：長30 cm、寬8 cm、高15 cm，呈120°的夾角，三臂相交區域為隔離區。實驗開始，隨機選定1個Y迷宮臂為起始臂，整個過程黑色隔板擋住3 個臂末端，觀察大鼠8 min 內進入各臂情況。連續3 次均進入不同的工作區，記正確1 次，否則視為錯誤。行為正確率（%）=正確次數/總檢測次數×100%。

3.4 血清S100B 和NSE 水平的檢測 各組大鼠采用2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉處死后采集腹主動脈血，離心后保留血清置于-80℃備用。采用ELLSA 法檢測血清S100B 和NSE 的水平，具體步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

3.5 海馬 IL-1β、IL-6和TNF-α 含量的檢測 隨機選取各組5 只大鼠麻醉處死，斷頭取腦，采集海馬組織，迅速置于液氮中保存備用。制備海馬組織勻漿液，采用ELLSA 法檢測各組大鼠海馬組織勻漿中IL-1β，IL-6 和TNF-α 含量，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

3.6 HE 染色 隨機選取5 只大鼠采集海馬組織CA3 區于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋組織，以6 μm 厚度進行切片保存備用。進行HE 染色，光鏡下觀察海馬神經元形態學變化。

3.7 海馬 TLR4 及 NF-κB p65 mRNA 水平的檢測提取各組5 只大鼠海馬組織總RNA，反轉錄得到cDNA，置于-20℃保存備用。采用RT-qPCR 檢測TLR4及 NF-κB p65 的 mRNA 表達水平，反應條件為：95℃30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40 個循環，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。TLR4 的上游引物序列為5′-CTCTCTACCTTAATATGA-3′，下游引物序列為5′-CCGATGTTAGAATAGGTTAGAAAG-3′；NF- κB p65 的上游引物序列為5′-ATGTGCATCGGCAAGTGG-3′，下游引物序列為 5′-CAGAAGTTGAGTTTCGGGTAG-3′；內參照GAPDH 的上游引物序列為5′-ACCACCATGGAGAAGGCTGG-3′，下游引物序列為5′-CTCAGTGTAGCCCAGGATGC-3′。采用 2-ΔΔCt法分析TLR4及NF-κB p65的mRNA相對表達水平。

3.8 海馬TLR4 和NF-κB p65 蛋白表達量的檢測采用 Western blot 檢測海馬組織 TLR4 及 NF-κB p65的蛋白表達量。蛋白提取試劑盒提取各組剩余5 只大鼠海馬組織總蛋白，BCA 法測定蛋白質濃度，進行SDS-PAGE，并轉膜、封閉，分別添加TLR4（1∶300）、NF-κB p65（1∶500）和 GAPDH（1∶2 000）抗體，4℃孵育過夜，添加Ⅱ抗IgG（1∶5 000）室溫避光孵育1 h，增強化學發光法顯影，蛋白條帶灰度值用ImageJ 軟件分析。

4 統計學處理

采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析，計量數據采用均數±標準差（mean±SD）表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組大鼠Morris水迷宮實驗結果的比較

與NC 組比較，M 組大鼠逃避潛伏期顯著延長（P＜0.01）；與M 組比較，Gen-L、Gen-M和Gen-H 組大鼠逃避潛伏期依次縮短（P＜0.01）；與Gen-H 組比較，Gen-H+LPS 組大鼠逃避潛伏期顯著延長（P＜0.01），見圖1。

Figure 1.Compared results of Morris water maze experiment in each group.Mean±SD. n=20.**P＜0.01 vs NC group；##P＜0.01 vs M group；&&P＜0.01 vs Gen-H group.圖1 各組大鼠Morris水迷宮實驗結果的比較

2 各組大鼠Y迷宮行為學指標的比較

與NC 組比較，M 組大鼠行為正確率顯著降低（P＜0.01）；與M 組比較，Gen-L、Gen-M和Gen-H 組大鼠行為正確率依次增加（P＜0.01）；與Gen-H 組比較，Gen-H+LPS 組大鼠行為正確率顯著降低（P＜0.01），見圖2。

Figure 2.Comparison of behavioral indexes of Y maze in each group.Mean±SD. n=20.**P＜0.01 vs NC group；##P＜0.01 vs M group；&&P＜0.01 vs Gen-H group.圖2 各組大鼠Y迷宮行為學指標的比較

3 各組大鼠海馬神經元形態學的變化

NC 組大鼠海馬神經元形態正常，胞核呈藍染，核仁明顯；M 組和Gen-H+LPS 組大鼠海馬神經元細胞核固縮深染，細胞變形、凋亡明顯；Gen-L、Gen-M和Gen-H組神經元形態病變減輕，見圖3。

4 各組大鼠血清S100B和NSE蛋白水平的比較

與 NC 組比較，M 組大鼠海馬 S100B和NSE 蛋白表達量顯著增加（P＜0.01）；與M 組比較，Gen-L、Gen-M和Gen-H 組大鼠海馬 S100B和NSE 蛋白表達量依次降低（P＜0.01）；與Gen-H 組比較，Gen-H+LPS 組大鼠海馬S100B 和NSE 蛋白表達量顯著增加（P＜0.01），見圖4。

5 各組大鼠海馬 IL-1β、IL-6和TNF-α 含量的比較

與 NC 組比較，M 組大鼠海馬 IL-1β、IL-6和TNF-α 含量顯著增加（P＜0.01）；與M 組比較，Gen-L、Gen-M和Gen-H 組大鼠海馬 IL-1β、IL-6和TNF-α 含量依次降低（P＜0.05）；與Gen-H 組比較，Gen-H+LPS 組大鼠海馬 IL-1β、IL-6和TNF-α 含量顯著增加（P＜0.01），見圖5。

Figure 3.Morphological changes of hippocampal neurons in each group（HE staining，×200）.圖3 各組大鼠海馬神經元形態學變化

6 各組大鼠海馬 TLR4 及 NF-κB p65 的 mRNA 水平比較

與 NC 組比較，M 組大鼠海馬 TLR4 及 NF-κB p65 mRNA 水平顯著增加（P＜0.01）；與 M 組比較，Gen-L、Gen-M和Gen-H 組大鼠海馬 TLR4 及 NF-κB p65 mRNA 水平依次降低（P＜0.01）；與 Gen-H 組比較 ，Gen-H+LPS組大鼠海馬TLR4及NF-κB p65 mRNA水平顯著增加（P＜0.01），見圖6。

Figure 4.Comparison of serum S100B and NSE protein levels in each group.Mean±SD. n=20.**P＜0.01 vs NC group；##P＜0.01 vs M group；&&P＜0.01 vs Gen-H group.圖4 各組大鼠血清S100B、NSE蛋白表達水平比較

Figure 5.Comparison of IL-1β，IL-6 and TNF-α contents in hippocampus of rats in each group.Mean ± SD. n=5.**P＜0.01 vs NC group；##P＜0.01 vs M group；&&P＜0.01 vs Gen-H group.圖5 各組大鼠海馬IL-1β、IL-6和TNF-α含量比較

Figure 6.Comparison of mRNA levels of TLR4 and NF-κB p65 in hippocampus of rats in each group.Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs NC group；##P＜0.01 vs M group；&&P＜0.01 vs Gen-H group.圖6 各組大鼠海馬TLR4及NF-κB p65 mRNA水平比較

7 各組大鼠海馬TLR4 和NF-κB p65 蛋白表達量的比較

與 NC 組比較，M 組大鼠海馬 TLR4 及 NF-κB p65蛋白表達量顯著增加（P＜0.01）；與M組比較，Gen-L、Gen-M和Gen-H 組大鼠海馬 TLR4 及 NF-κB p65 蛋白表達量依次降低（P＜0.01）；與Gen-H 組比較，Gen-H+LPS 組大鼠海馬 TLR4 及 NF-κB p65 蛋白表達量顯著增加（P＜0.01），見圖7。

Figure 7.Comparison of protein expression of TLR4 and NF-κB p65 in hippocampus of rats in each group.Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs NC group；##P＜0.01 vs M group；&&P＜0.01 vs Gen-H group.圖7 各組大鼠海馬TLR4和NF-κB p65蛋白表達量比較

討 論

小平臺水環境法是對大鼠進行睡眠剝奪處理的常用方法，此法可完全剝奪大鼠快波睡眠，且可阻止慢波睡眠和異相睡眠的發生，簡單可靠。研究顯示，睡眠具有抗氧化應激作用，睡眠剝奪可導致人體記憶力下降，情緒行為異常及腦海馬組織應激損傷及炎癥反應等［11-14］。崔建梅等［15］研究報道，睡眠剝奪可引起海馬神經元損害，與對照組比較，睡眠剝奪模型大鼠工作記憶錯誤次數、參考記憶錯誤次數顯著增加，正確反應次數減少、完成八臂迷宮時間顯著延長。本研究結果發現，與NC 組比較，M 組大鼠逃避潛伏期顯著延長、行為正確率顯著降低，海馬神經元損傷明顯，血清S100B、NSE 蛋白表達顯著增加。S100B 蛋白是由神經系統星形膠質細胞分泌的一種鈣結合蛋白，主要存在于腦組織，可參與神經元信息傳遞，腦損傷時可釋放入血；NSE 存在于神經元、神經外胚層細胞和紅細胞中，血清NSE 水平是一種與腦損傷程度相關的診斷和預后指標；血清S100B 和NSE 蛋白含量增加，提示存在神經元、星形膠質細胞、神經末梢等腦微結構損傷，與失眠癥嚴重程度或/認知功能障礙有關［16-17］。本研究結果表明睡眠剝奪后大鼠出現認知功能障礙，證實睡眠剝奪大鼠模型制備成功，可用于后續實驗。本研究結果還發現，與模型組比較，Gen呈劑量依賴性縮短大鼠逃避潛伏期、增加其行為正確率，與陳曉燕等［8］研究報道的Gen 可有效改善糖尿病模型大鼠認知障礙的結果一致，提示Gen 可能對睡眠剝奪大鼠認知障礙具有一定改善作用。

梔子為茜草科植物，其重要成分為Gen，具有消炎、抗氧化和降血糖等作用。許玲夏等［6］研究報道，Gen 可降低非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝組織IL-1β、IL-6 和TNF-α 等炎癥因子水平，改善腸粘膜組織結構。孫源博等［18］研究報道，Gen 可通過抑制 TGF-β1/Smad 信號通路，降低炎癥因子 IL-1β和TNF-α 釋放、減輕氧化應激反應，改善腎間質纖維化。本研究結果發現，與 NC 組比較，M 組大鼠海馬 IL-1β、IL-6、TNF-α 含量顯著增加，IL-1β、IL-6 和TNF-α 是常見促炎因子，提示睡眠剝奪大鼠海馬組織存在炎癥反應。與M 組比較，Gen 可呈劑量依賴性下調海馬IL-1β、IL-6和TNF-α 含量，提示 Gen 可能通過減少海馬 IL-1β、IL-6 和TNF-α 等促炎癥因子合成與釋放，改善睡眠剝奪大鼠認知功能障礙。

TLR 可特異性識別病原相關分子模式，通過跨膜結構將病原相關分子刺激信號轉入細胞中，導致NF-κB 等誘導因子活化，介導 IL-1、IL-6 及 TNF-α 等炎癥介質基因表達，導致炎癥介質合成及釋放，誘導炎癥反應及啟動病原微生物的固有和獲得性免疫［19-20］。王羲鳳等［21］研究報道，睡眠剝奪可導致老齡大鼠血腦屏障通透性增加，激活海馬TLR4／NF-κB信號通路誘發炎癥反應，降低認知功能。Liu 等［22］研究報道，Gen 通過抑制 BTK/TLR4/NF-κB 通路，減少海馬IL-6 及TNF-α 等炎癥因子釋放，改善糖尿病大鼠認知功能障礙。本研究結果發現，與正常對照組比較，模型組大鼠海馬 TLR4、NF-κB p65 的 mRNA 及蛋白表達量顯著增加；與模型組比較，Gen 呈劑量依賴性降低睡眠剝奪大鼠海馬TLR4 及NF-κB p65 的mRNA 及蛋白表達量，可能因為睡眠剝奪后異常慢波放電導致大腦網絡抑制或受損，進而激活氧化應激、炎癥反應等，導致海馬區突觸穩態破壞等原因會引起大鼠認知障礙［23］，其中TLR4/NF-κB 是炎癥調控中最關鍵和最常見的通路，而Gen 改善睡眠剝奪大鼠認知功能可能與抑制TLR4/NF-κB p65 通路，減少其下游炎癥因子分泌有關，但關于Gen 作用TLR4/NF-κB p65 通路的直接靶點有待進一步深入探究。LPS 是TLR4 信號通路的激活劑，本研究發現對Gen-H組大鼠進行尾靜脈注射LPS后，結果發現睡眠剝奪大鼠逃避潛伏期顯著延長、行為正確率顯著降低，海馬神經元損傷明顯，血清S100B 和NSE 的水平、海馬IL-1β、IL-6和TNF-α 的含量及 TLR4、NF-κB p65 的mRNA 及蛋白表達量顯著增加，提示LPS 激活TLR4通路可逆轉Gen 減輕認知功能障礙的作用，再次印證 Gen 是通過抑制 TLR4/NF-κB p65 通路，減輕海馬炎癥反應，從而改善睡眠剝奪大鼠認知功能障礙的。

綜上所述，梔子苷可通過抑制TLR4/NF-κB p65信號通路，減輕海馬炎癥反應，從而改善睡眠剝奪大鼠認知功能障礙，可對臨床睡眠障礙治療提供新的思路，具有一定臨床應用價值。但關于Gen 臨床用藥的安全劑量、作用TLR4/NF-κB p65 通路的直接靶點及是否涉及其他信號通路參與有待進一步驗證。