煙草青枯病抗性的全基因組關聯分析

何斌彬，耿銳梅，楊愛國，任 民*

（1.中國農業科學院煙草研究所，青島 266101；2.中國農業科學院研究生院，北京 100081）

煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）侵染引起的一種土傳細菌病害，可侵染50 多科的數百種植物[1]，在世界范圍內均有發生，近年在我國危害程度逐漸上升，且發病區域有向北蔓延的趨勢[2]，已成為我國煙草生產中的主要病害之一。

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已有研究表明煙草青枯病抗性遺傳較為復雜[3]。利用晾曬煙[4]、香料煙[5]及烤煙[2]進行的青枯病抗性遺傳分析表明，在不同煙草類型以及同類型不同品種間的青枯病抗性遺傳規律差異均較大，來源于同一抗源親本的品種之間，其遺傳規律也并非完全一致，但基本認為煙草青枯病抗性為多基因控制且具有加性效應。有關煙草青枯病抗性QTL 的定位研究開展較早[6]，利用AFLP、SSR 等分子標記，在不同的分離群體內，鑒定到了多個青枯病抗病QTL 位點；利用MELP 和SSR 標記，探索了基于關聯分析的青枯病抗性位點發掘，并取得一定研究進展[7-8]。但由于上述研究普遍采用的是基于酶切和PCR 的二代分子標記技術，其標記數量有限，定位區間較大，且缺乏基因組信息支撐，限制了研究結果在抗病基因克隆和抗病分子標記輔助選擇育種中的應用。

近年來，隨著高通量測序技術的快速發展，單核苷酸多態性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）和插入缺失突變（Insertion-Deletion，InDel）等新一代分子標記在動植物遺傳研究中得到了廣泛的應用。與SSR 等傳統分子標記技術相比，SNP標記具有數量多、密度高、分布廣泛等優勢[9]?；诤喕蚪M測序的RAD 技術（Restriction siteassociated DNA sequencing，RAD-seq），在實現基因組全覆蓋的同時，還能大幅降低測序成本[10]，非常適合煙草這類基因組龐大的作物。本研究以219 份國內外表型變異豐富、遺傳多樣性較高的烤煙品種組成的自然群體作為研究材料，利用RAD 簡化基因組重測序技術，對煙草青枯病抗性進行全基因組關聯分析，發掘與抗性變異顯著關聯的區段，并預測抗病候選基因，為開展煙草青枯病抗性分子育種奠定基礎。

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1 材料與方法

1.1 供試材料

在關聯分析的基礎上，利用煙草基因組數據庫，根據上述對煙草烤煙品種群體的LD 衰減距離分析結果，在與關聯峰值SNP 位點上下游各256 kb 的LD 區間內共篩選到18 個基因，詳細信息見表2。根據基因功能注釋信息及相關研究報道，推測Ntab0717150、Ntab0717130、Ntab0080360和Ntab0080340這4 個基因可能與青枯病抗性相關。

1.2 簡化基因組重測序及SNP 鑒定

通過RAD-Seq共發掘到高質量SNP位點384 904個，篩選到非缺失個體不少于190 的SNP 位點共338 315 個，用于計算LD 衰減距離。通過滑動窗口法共獲得16 914 526 組LD 數據，其中r2達顯著水平以上的有2 071 065 組，占比12.24%。繪制LD衰減曲線（圖2），以r2低于0.5 為臨界值（SNP 位點間最高值1.0，初始窗口r2平均值0.92），在此條件下，煙草烤煙品種群體的LD衰減距離為256 kb。

1.3 病情調查

在移栽后60 d 發病期進行青枯病病情調查，參照行業標準GB/T 23222—2008，根據煙株莖部條斑和葉片凋萎情況將發病等級分為5 級，并根據病級計算每個供試品種的病情指數，根據供試材料的病情指數將品種抗病性分為6 類。

1.4 數據分析

關聯峰值位點C17_23 977 382 在群體上的分型情況見表1，在群體上有AA、GG、AG 三種基因型，其中AA 型有23 個品種（10.5%），GG 型有188個品種（85.8%），AG 型有6 個品種（2.7%），缺失2 個品種（0.9%）。方差分析結果表明，等位變異A能夠極顯著（p＜0.0001）大幅降低病情指數，是優異等位變異（圖6）。

1.4.2 全基因組關聯分析 利用TASSEL V 5.0[14]軟件的MLM（PCA+K）模型進行全基因組關聯分析，具體步驟同文獻[12]。

供試品種的病情指數在各個區間均有分布，而抗病性主要分布在中抗、中感和感病3 個等級（圖1），供試群體病情指數的偏度系數Skewness 為0.051，峰度系數Kurtosis 為-1.078，基本符合正態分布。共鑒定出8 個高抗青枯病的煙草品種，分別為Coker176、Special400、巖煙97、白色種、大青筋、Y-2、丸葉和K358，病情指數均為0。

1.5 候選基因預測

通過煙草基因組數據庫（http://218.28.140.17/），獲得關聯區段內基因功能注釋信息。

利用供試群體的青枯病抗性調查數據，與SNP群體分型數據進行了全基因組關聯分析，由關聯分析結果的Q-Q 圖可知（圖3），本研究所選用模型適宜，關聯分析效果理想。以關聯位點的p值小于1×10-6為多重檢驗（FDR）的顯著性閾值，在此閾值之上共發掘到1 個關聯SNP 區段（圖4），其峰值SNP（C17_23 977 382）位于17 號染色體的23 977 382 bp 處（圖5），p值為6.196×10-7，能解釋14.29%的表型變異。

2 結果

2.1 供試群體的抗病性分析

首先，“營改增”政策對生產性服務業上市公司減稅效應顯著。由理論分析可知，“營改增”的減稅效應主要取決于企業的外購商品及勞務能取得可抵扣進項的多少，實證分析表明，“營改增”后，企業外購商品及勞務增加，使企業總稅負降低。同時，外購商品及勞務對企業稅負下降的影響遠大于“營改增”政策所帶來的減稅效應。

圖1 供試群體抗病性分布Fig.1 The distribution of disease resistance in the test population

2.2 烤煙染色體LD 衰減分析

RAD 簡化基因組重測序及SNP 鑒定與華大基因有限公司合作開展，參考基因組為煙草栽培品種紅花大金元（V 4.0），建庫酶切、高通量測序、SNP鑒定流程等參見文獻[12]。

2.3 供試群體SNP 變異位點與青枯病抗性的全基因組關聯分析

目前世界上大部分國家和地區都使用UTM投影。幾內亞使用克拉克1880橢球，UTM投影，而我國已全面使用2000國家大地坐標系，國內通常使用高斯-克呂格(Gauss-Kruger)投影(以下簡稱高斯投影)。根據我國《工程測量規范(GB50026—2007)》：平面控制網的坐標系統，應在滿足測區內投影長度變形值不大于2.5 cm/km的要求下(相對誤差小于1/400 00)，進行坐標系的選擇。因此，必須熟悉和了解幾內亞國家所使用的地球橢球及投影方式，才能建立好合適的坐標系統。

圖2 烤煙品種群體的LD 衰減圖Fig.2 LD attenuation map of flue-cured tobacco varieties

圖3 青枯病抗性關聯分析的Q-Q plot 圖Fig.3 Quantile-quantile plot of association analysis of bacterial wilt resistance

圖4 供試群體青枯病抗性的全基因組關聯分析Fig.4 Genome-wide association analysis of bacterial wilt resistance in the test population

圖5 17 號染色體上青枯病抗性關聯分析的曼哈頓圖Fig.5 Manhattan plot of association analysis of bacterial wilt resistance on chromosome 17

2.4 抗青枯病優異等位變異的篩選

1.4.1 連鎖不平衡衰減距離計算 從全部SNP 位點中篩選非缺失個體不少于190 個的SNP 位點，利用Haploview 4.2[13]軟件進行SNP 間的連鎖不平衡（Linkage disequilibrium，LD）分析，計算50 個SNP以內兩兩位點間的LD 參數r2。用滑動窗口法統計r2的平均值，其窗口長度為36 kb，步長0.8 kb，繪制成LD 衰減曲線。

2.5 青枯病抗性相關基因

供試群體包括219 份國內外烤煙品種，由國家煙草種質資源中期庫[11]提供。2016 年，供試材料種植于安徽宣城田間病圃，隨機區組試驗設計，2016年7 月調查田間自然發病情況。

表1 219 份供試材料分型結果Table 1 Typing results of 219 tested materials

表1（續）

圖6 不同等位變異之間的表型差異Fig.6 Phenotypic differences between different alleles

3 討 論

在之前的報道中[6]，多數利用RAPD、AFLP 和SSR 等分子標記技術，通過連鎖分析或關聯分析的方法定位到一些與煙草青枯病抗性相關的位點，但存在標記非特異性、密度低和缺少基因組物理圖譜信息等問題。得益于近年來快速發展的高通量測序技術，本研究與以往研究相比，實現了更高密度的基因組覆蓋，同時關聯到的SNP 位點具有明確的物理圖譜位置，有助于研究的深入開展和互相驗證。本研究通過全基因組關聯分析策略，在煙草基因組內定位到1 個與煙草青枯病抗性變異顯著關聯的區段，峰值SNP 在17 號染色體的23 977 382 bp 處（C17_23 977 382），LAN 等[15]在煙草的17 號連鎖群上檢測到一個與煙草青枯病抗性相關的QTL（qBWR17a），能夠解釋30%的表型變異。本研究對煙草高密度SSR 遺傳圖譜利用電子PCR 及序列比對的方法，進行了SSR 標記的紅花大金元物理圖譜定位（數據未展示），其中上述17 號連鎖群基本對應17 號染色體，因此本研究與LAN 等[15]研究結果較為一致。

表2 參考基因組第17 號染色體關聯區段內18 個基因的注釋信息Table 2 Annotation information of 18 genes in the association region of chromosome 17 of the reference genome

植物基因組LD 衰減距離決定關聯分析時所需的標記密度，在一定程度上也決定了候選基因的定位精度[16]。本研究發現，煙草烤煙品種群體的LD衰減距離為256 kb，與其他作物相比，屬于LD 衰減較慢的物種，顯著低于玉米（1～5 kb）[17]、秈稻（10 kb）[18]、芝麻（88 kb）[19]，與番茄（256.8 kb，CER 群體）[20]、馬鈴薯（450～550 kb）[21]等茄科作物處于一個數量級。原因可能是烤煙品種群體經過長期的馴化選擇，導致群體遺傳多樣性下降，位點間的相關性（連鎖程度）加強，導致LD 衰減速度相對較慢[22]。

通過候選基因預測，共找到4 個可能與青枯病抗性相關的基因，分別為Ntab0717150、Ntab0717130、Ntab0080360和Ntab0080340。其中Ntab0717150和Ntab0717130與擬南芥AT5G15900基因同源，該基因為TBL（Trichome birefringencelike）基因家族成員，已有研究表明該家族基因參與細胞次級壁纖維素的合成和沉積[23]，推測基因Ntab0717150和Ntab0717130可能通過促進細胞壁的合成進而增強植物抵抗青枯病的能力；基因Ntab0080360和Ntab0080340與擬南芥AT1G22710基因同源，該基因編碼蔗糖轉運蛋白（Sucrose transporter，SUT）[24]，已有研究表明，煙草中NtSUT1基因的反義表達會大大增加黑斑病的感病率[25]，番茄中SlSUT2基因的反義表達會使植株的菌根侵染率顯著提高[26]，推測基因Ntab0080360和Ntab0080340可能通過影響根系發育進而參與青枯病的抗病進程。后續擬利用基因敲除和過表達對上述4 個基因進行功能驗證。

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4 結 論

本研究首次利用SNP 標記和全基因組關聯分析策略相結合的方法，對219 份煙草自然群體種質材料進行青枯病抗性分析，在煙草基因組內定位到1 個與青枯病抗性變異顯著關聯的區段，該區段峰值SNP 位于17 號染色體的23 977 382 bp 處，并在該區段篩選到4 個煙草青枯病抗病候選基因。該研究結果為后續青枯病抗病基因克隆及分子育種奠定了基礎。