外施赤霉素對薄殼山核桃幼苗生長及相關代謝基因表達的影響

嚴澤埔，張佳琦，梁 璧，魏廣利，張啟香，王正加

（浙江農林大學 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300）

薄殼山核桃Carya illinoensis又稱長山核桃、美國山核桃，為世界著名的高檔干果、油料樹種和材果兼用優良樹種，其果實營養豐富，保健價值高[1]。研究發現：長期食用薄殼山核桃有明顯的防衰老、健腸胃、防治心血管疾病等作用[2]。然而，薄殼山核桃樹體高大，不利于人工采摘果實及日常的養護管理，培育矮化砧木可為薄殼山核桃育種工作及果品的推廣提供便利。魏靈珠等[3]提出：赤霉素(gibberellins，GA3) 是調控植物株高的重要激素，相關株高基因的克隆與分子機制研究對于合理調控植物生長發育和農業生產具有極其重要的利用價值。赤霉素作為一類二萜類植物激素，調節種子萌發[4?5]、莖桿伸長[6]、花粉管生長[7]、花和種子發育[8]等多種生理活動，也能在環境脅迫下調控植物的生長和發育[9]。其中，值得關注的是赤霉素通過促進節間伸長來調控植株的營養生長[10]。目前，已經克隆到赤霉素生物合成大多數步驟催化酶的基因，構建了從前體分子到活性赤霉素的整體合成框架[11]。研究發現：赤霉素后期的代謝酶(GA20ox、GA3ox、GA2ox)對活性赤霉素的精確調控具有關鍵作用[12]。GA20氧化酶(GA20-oxidase, GA20ox)是赤霉素合成過程中關鍵的限速酶，在棉花Gossypiumspp.[13]、毛白楊Populus tomentosa[14]和山茶Camellia reticulata[15]中過表達會使得植株增高，抑制該基因在煙草Nicotiana tabacum[16]、蘋果Malus domestica[17]等植株中表達則會使植株矮化。鄧偉等[14]通過農桿菌介導法在毛白楊中過量表達棉花GA20ox使得楊樹的莖伸長，但減少了葉片和根的生長。趙愷[17]通過農桿菌介導法將GA20ox的干擾信號轉入蘋果中，獲得了蘋果的矮化砧木。GA3氧化酶(GA3-oxidase, GA3ox)則是赤霉素合成過程中的一個關鍵酶。研究發現：抑制小麥Triticum aestivum[18]和水稻Oryza sativa[19]中的GA3ox基因表達，植株會呈現矮化的性狀。劉穎等[18]發現：在矮桿小麥‘寧98-2105’中，GA3ox1和GA3ox2在莖的倒一節結節中的轉錄水平顯著高于對照，推測是赤霉素傳導通路受到影響導致植株突變。而過量表達赤霉素合成過程中的另一個關鍵酶赤霉素氧化酶(GA2-oxidase, GA2ox)，也會使麻瘋樹Jatropha curcas[20]、荔波連蕊茶Camellia lipoensis[21]和矮牽牛Petunia hybrida[22]等植株矮化。HU等[20]運用農桿菌介導法在麻瘋樹中過表達JcGA2ox發現：植株呈現矮化，更小更深的葉片，花序果實都變小的性狀。本研究以薄殼山核桃幼苗為實驗材料，于生長期噴施100 mg·L?1的赤霉素，研究其對薄殼山核桃幼苗生長的影響和赤霉素合成代謝關鍵基因的時空變化，初步了解薄殼山核桃GA20ox、GA3ox和GA2ox基因的時空表達特征及在赤霉素合成中的調控作用，為薄殼山核桃矮化新種質育種奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與處理

實驗薄殼山核桃種子是半同胞家系，2018年10月采摘于浙江農林大學同一株樹，挑選大小一致的種子作為實驗材料。晾曬后置于塑封袋內，置于4 ℃保存。2019年4月，將薄殼山核桃種子種在基質土 [m(泥炭)∶m(珍珠巖)∶m(蛭石)=1∶1∶1]內，在亞熱帶森林培育國家重點實驗室的馴化室 [(25±2) ℃，濕度為75%]進行萌發培養。2019年5月，選取生長勢、株高、節間長度和主根長度等形態指標基本一致的幼苗 54 株，葉面噴施 100 mg·L?1的赤霉素 (CAS: 77-06-5, BC, 上海生工)進行處理 (24 h 內不澆水)，以去離子水為對照，3次重復。

1.2 方法

1.2.1 處理后薄殼山核桃幼苗形態指標測定 處理 28 d 后測量植株高度、頂芽至第 1葉節間長度和主根長度，均用直尺測量，保留1位小數。采用SPSS 17.0中的單因素方差分析對所有指標進行統計處理，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

1.2.2 赤霉素代謝關鍵基因的生物信息學分析 薄殼山核桃、山核桃Carya cathayensis和核桃Juglans regia的GA20ox、GA3ox和GA2ox均由浙江農林大學省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室張啟香課題組克隆。從美國國家生物信息中心(NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上分別搜索已報道的植物GA20ox、GA3ox、GA2ox同源基因的氨基酸序列，通過軟件DNAMAN進行氨基酸序列比對。利用ITOL (https://itol.embl.de/)和MEGA制作系統進化樹。

1.2.3 赤霉素相關基因的時空表達分析 對處理 0、7、14、21 和 28 d 后植株的葉片進行采樣，用于基因不同時間表達變化；基因不同空間表達變化采用處理0和28 d后植株的頂芽、葉①、莖①、葉②、莖②、葉③、莖③、葉④、莖⑤和根(圖1)。樣品采集后立即放入液氮，總RNA的提取方法按照RNAprep pure Plant Kit(北京天根)及其說明書提供的 方 法 進 行 。 用 Prime ScriptTM RT Master Mix(TaKaRa公司)反轉錄合成cDNA。

圖 1 薄殼山核桃不同組織部位示意圖Figure 1 Schematic diagram of different tissurs in C. illinoensis

表 1 引物序列Table 1 Primers sequences

根據基因序列，利用Primer3Input(http://primer3.ut.ee/)設計定量引物，以山核桃Actin基因為內參，引物序列見表1。熒光定量PCR反應體系為10.0 μL，包含 cDNA 0.4 μL，TBGREEN (TaKaRa公司)5.0 μL，正向引物 0.2 μL，反向引物 0.2 μL，雙蒸水 4.2 μL。反應條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 31 s，40 個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃30 s，60 ℃ 15 s。數據分析采用 7300system 軟件和2???Ct的方法，ΔΔCt= (Ct靶基因?Ct內參)處理組?(Ct靶基因?Ct內參)對照組[23?24]。圖表由 Excel 2007 軟件制作。

2 結果與分析

2.1 外源赤霉素處理對薄殼山核桃幼苗生長指標的影響

由圖2A可知：處理28 d后，薄殼山核桃植株平均生長量達2.9 cm，對照組平均生長量僅為1.5 cm，處理后為對照的1.93倍，差異極顯著(P＜0.01)。外源赤霉素可以有效刺激薄殼山核桃的營養生長，顯著促進了莖的生長。經過赤霉素處理后，薄殼山核桃從頂芽至第1葉莖節間長度伸長量為對照的1.14倍，差異顯著 (P＜0.05)，但節的數量沒有發生變化(圖2B)。此外，赤霉素對根系生長也有良好的促進作用。赤霉素處理28 d后薄殼山核桃主根長伸長量是對照組的1.09倍，差異顯著(P＜0.05)(圖2C)。

2.2 薄殼山核桃赤霉素代謝關鍵基因CiGA20ox、CiGA3ox和CiGA2ox的生物信息學分析

將CiGA20ox、CiGA3ox和CiGA2ox基因編碼的氨基酸序列與NCBI數據庫的GA20ox、GA3ox和GA2ox蛋白氨基酸序列進行比對分析 (圖 3)。發現 CiGA20ox(圖 3A)、CiGA3ox(圖 3B)和 CiGA2ox(圖3C)都有著相應的保守20G-FeⅡ-Oxy蛋白結構域，以及2-酮戊二酸結合位點和亞鐵離子(Fe2+)結合位點。說明CiGA20ox、CiGA3ox和CiGA2ox屬于相應的赤霉素氧化酶家族。

圖 2 GA3 處理對薄殼山核桃幼苗生長的影響Figure 2 Effect of GA3 treatment on seedling growth of C. illinoensis

圖 3 CiGA20ox、CiGA3ox 和 CiGA2ox 氨基酸序列與其他其同源序列的比對Figure 3 Amino acid alignment of CiGA20ox，CiGA2ox、CiGA3ox and its closest homologues

在進化關系圖 (圖 4)中，CiGA2ox、CiGA20ox和CiGA3ox與山核桃和核桃的親緣關系較近，且與山核桃的親緣關系最近。可見同科植物的GA20ox、GA2ox和GA3ox蛋白同源關系較近，這與該蛋白的序列相似性分析結果相一致，表明薄殼山核桃GA20ox、GA2ox和GA3ox蛋白在進化方面較為保守。

2.3 薄殼山核桃赤霉素代謝關鍵基因CiGA20ox、CiGA3ox和CiGA2ox表達的時間變化

對薄殼山核桃幼苗噴施 100 mg·L?1赤霉素，通過qRT-PCR檢測并分析其在處理后不同時期 (0、7、14、21、28 d)CiGA20ox、CiGA3ox和CiGA2ox的相對表達量特征。

定量結果顯示：噴施 100 mg·L?1赤霉素可在短期內抑制CiGA20ox的轉錄。在前期，CiGA20ox表達量相對平穩，在處理14 d后，CiGA20ox的表達量快速下降，處理21 d后，表達量為初始值的59.1%，之后持續緩慢下降，28 d后的表達量僅為初始值的38.6%(圖5A)。

在赤霉素處理后CiGA3ox表達量呈先下降后上升的趨勢。處理7 d后表達量到達最低點，為對照的48.6%，之后緩慢升高，于處理21 d后回升至處理前水平。后快速上升，于處理28 d后到達頂點，表達量為初始值的350%。與GA20ox基因表達情況不同的是在赤霉素處理21 d后，GA3ox表達量迅速提高到較高的水平，可能是GA3ox在赤霉素質量濃度下降時起更重要的反調節作用，以保持植物體內的赤霉素水平，具體調控機制尚不明確(圖5B)。

圖 4 GA20ox、GA3ox 和 GA2ox 的系統進化樹Figure 4 An unrooted phylogenetic tree representing relationships of GA20ox，GA3ox and GA2ox

圖 5 赤霉素處理后 CiGA20ox、CiGA3ox、CiGA2ox 基因轉錄水平的變化Figure 5 Transcript levels of CiGA20ox，CiGA3ox，CiGA2ox after GA3 treatments

赤霉素代謝過程中的另一個關鍵酶CiGA2ox表達量總體則呈波浪形變化，在7 d后達到頂峰，之后緩慢下降，14 d后快速下降至21 d時恢復到了對照水平，28 d后再次上升為初始值的220%(圖5C)。

2.4 薄殼山核桃赤霉素代謝關鍵基因CiGA20ox、CiGA3ox和CiGA2ox的空間變化

本研究通過qRT-PCR對薄殼山核桃幼苗不同部位赤霉素代謝關鍵基因GA20ox、GA3ox和GA2ox的相對表達量開展了研究。由植株上端至下端命名不同部位 (圖1)。

結果顯示：薄殼山核桃GA20ox在不同部位均有表達，但是不同部位分布不均，主要分布在植株的頂芽、葉片和根內，分布規律大致為在葉片中是由頂芽向葉④逐漸遞減，在莖中是由莖①至莖⑤逐漸遞增(圖6A)。赤霉素處理過后，各個部位的GA20ox基因表達量均下降，說明在赤霉素處理28 d后，CiGA20ox的各部位表達均受到了抑制，但是表達模式沒有發生變化，頂芽中最多，其次是葉片內表達量大于莖稈中的表達量。

薄殼山核桃GA3ox基因表達量相對較少，存在組織特異性，主要集中在植株頂芽和莖中，在葉片中表達量較少(圖6B)。但是在外施赤霉素后可以發現：除了根部，GA3ox在其他部位均有上升，而在莖中的增加量大于在葉片中的增加量。

薄殼山核桃GA2ox在各個部位均有分布，主要分布在薄殼山核桃的頂芽和葉片內，在莖桿部位幾乎不表達(圖6C)。經過赤霉素處理后，CiGA2ox在靠近植株頂端的莖中，相對含量發生了累積，而葉片中的GA2ox轉錄受到了抑制。

圖 6 薄殼山核桃 GA20ox、GA3ox 和 GA2ox 在不同組織部位的表達量Figure 6 Expression of GA20ox，GA3ox and GA2ox in different tissues in C. illinoensis

3 討論

在本研究中，外施赤霉素使得薄殼山核桃莖桿伸長，植株增高，并且在一定程度上促進了主根系的生長。李俊南等[25]用不同濃度的赤霉素浸泡薄殼山核桃種子后，增加了薄殼山核桃的發芽率，并且對薄殼山核桃幼苗的根莖影響較大。此外，劉芳等[26]對甜櫻桃Prunus avium外施赤霉素后，新梢生長量顯著高于對照，但是調節新梢長度的影響主要體現在調節其節數，對平均節間長度的作用并不顯著。這可能是植株新梢生長程度與植株整體并不一致造成的。

外施赤霉素使得薄殼山核桃幼苗內的赤霉素生物合成基因CiGA20ox和CiGA3ox表達量顯著下調，而CiGA3ox的表達量在處理后期出現了升高的現象，可能是因為GA3ox作為赤霉素生物合成的最后一步，在赤霉素質量濃度驟然升高或降低時，GA3ox起著更重要的反調節作用，從而維持植物體內赤霉素的平衡。該結果類似于赤霉素合成過程中的負反饋調節現象。而CiGA2ox則是呈現先上升后下降的波浪形趨勢，說明在外源赤霉素的作用下，隨著活性赤霉素物質量的增加，GA2ox表達量也在增加。郝鵬博[27]在對桃樹Prunus persica外施赤霉素后，桃樹的GA20ox、GA3ox呈下降趨勢，并于后期增加，GA2ox則是呈先上調后下降的趨勢，與本研究基本一致。這些結果均表現出赤霉素合成代謝酶GA20ox和GA3ox參與赤霉素負反饋調節，而GA2ox則是參與了正反饋調節。

本研究選取了薄殼山核桃的不同部位進行qRT-PCR 分析，通過組織特異性分析發現：赤霉素合成相關基因CiGA20ox和CiGA3ox均在頂端大量表達，參與合成活性赤霉素；而調控赤霉素代謝的基因家族CiGA2ox在中部和頂部也高表達，表明薄殼山核桃頂部的生命活動最旺盛。外施赤霉素后，薄殼山核桃頂端維持的赤霉素穩定程度被打破，CiGA20ox被抑制轉錄，CiGA3ox大量生成調控了植株生長，而CiGA2ox在莖中表達量上升以降解體內過多的赤霉素，以達到穩定的狀態保證植株穩定生長[28]。而這些基因相對含量的變化都與植株生長有著一定的聯系。

本研究通過對薄殼山核桃噴施100 mg·L?1赤霉素，對薄殼山核桃赤霉素代謝關鍵基因GA20ox、GA3ox和GA2ox進行了系統深入研究，為薄殼山核桃矮化分子育種提供了理論基礎。目前，張佳琦等[29]通過農桿菌介導法構建核桃的GA2ox同源轉化體系，已經得到了核桃的矮化再生植株。薄殼山核桃和核桃親緣關系較近，可以通過轉化矮化目的基因到植物體胚內，以期待得到薄殼山核桃良種矮化砧木。