基于SCoT標記的朱頂紅品種遺傳多樣性分析

王 黎，徐 郝，俞云棟，張海珍，高燕會，沈 笑，金晨鶯，陳軼敏

（1. 浙江農林大學 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300；2. 杭州植物園，浙江 杭州310027；3. 杭州西湖風景名勝區湖濱管理處，浙江 杭州 310002）

朱頂紅Hippeastrum rutilum又名紅花蓮、孤挺花等，系石蒜科Amaryllidaceae朱頂紅屬Hippeastrum所有種類的總稱，多年生草本植物，性喜溫暖、濕潤氣候，稍耐寒[1]。現有約70個種[2]在全球呈離散分布，野生種主要集中分布在巴西和玻利維亞一帶。在中國，朱頂紅屬外來引入花卉[3]。朱頂紅花色艷麗且復雜多變，花瓣形狀豐富，極具觀賞價值，除可用于一般的盆景植物外，還可用于戶外景觀植物栽培，是元旦、春節和國慶的重要裝飾。目前，國際上流行的園藝雜交種朱頂紅有100多個品種，其中在中國栽培的品種有60多個[4]。作為高檔觀賞花卉，國內外開展的對朱頂紅相關研究，主要集中在栽培技術(包括組培)、育種、擴繁技術和病蟲害防治等方面。近年來，育種學家們培育出了很多花型、花色變化豐富，花瓣厚和花期長的新品種[3]，但在國內推廣應用的朱頂紅品種主要引自荷蘭，缺少自主培育的新品種，而且朱頂紅的遺傳背景較復雜，無法確定大部分栽培品種的遺傳背景和品種間的親緣關系，采用傳統的分類方法很難區分其種下類群和品種[5]以及朱頂紅種質資源的遺傳多樣性分析數據[4]，因此，了解朱頂紅的遺傳多樣性對于朱頂紅遺傳育種具有重要意義。已有研究表明：簡單序列重復技術(ISSR)[6?7]已經成功應用于朱頂紅種質資源遺傳關系分析和品種鑒定，但這并不能完全反映朱頂紅遺傳多樣性。2009年COLLARD等[8]新開發的基于植物基因組起始密碼子ATG側翼序列的保守性，設計單引物對目的基因進行擴增的新型分子標記技術——目標起始密碼子多態性分子標記(start codon targeted polymorphism, SCoT)。ISSR引物擴增介于反向重復序列位點間的序列[9]，部分序列存在無法擴增的現象。與ISSR標記相比，SCoT標記單引物與ATG結合后擴增目的基因或其附近DNA序列[10]，有更為廣闊的DNA擴增范圍，其實驗結果更具有可靠性。目前，SCoT標記已經成功應用于花生Arachis[11]、茶樹Camellia sinensis[12?13]、梔子Gardenia jasminoides[14]、油菜Brassica rapa[15]、石蒜屬Lycoris[16]、獼猴桃Actinidia[17]、鐵皮石斛Dendrobium officinale[18]等植物遺傳多樣性、親緣關系分析和變異鑒定以及基因變異表達等方面。為了更進一步分析更多朱頂紅品種間的遺傳多樣性和親緣關系，本研究利用建立的SCoT標記體系對朱頂紅品種進行遺傳多樣性和親緣關系分析，旨在了解朱頂紅在分子水平上的遺傳變異，為朱頂紅雜交育種、種質資源保護和利用提供理論依據和技術基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

植物材料朱頂紅采自浙江農林大學遺傳學科朱頂紅植物種質資源圃，共計41個朱頂紅品種(表1)。于2019年4月采集朱頂紅花瓣，液氮冷凍并于?80 ℃冰箱保存備用。本研究所用引物是根據COLLARD等[8]設計的SCoT引物。

1.2 方法

1.2.1 朱頂紅基因組 DNA 提取與檢測 采用改良 CTAB 法[19]提取朱頂紅花瓣基因組 DNA，采用微量核酸測定儀(Nanodrop 2000)測定DNA的濃度和質量，并通過質量分數為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格的DNA樣品于?20 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 朱頂紅 SCoT-PCR反應體系的建立 為獲得朱頂紅 SCoT-PCR反應的最佳體系，參考姜小鳳[20]和潘媛等[14]報道的SCoT擴增反應條件，通過對PCR反應五要素(模板、引物、MgCl2、dNTPs、rTaqDNA聚合酶)進行5因素4水平正交實驗(，表2～3)。PCR擴增反應體系為20 μL，PCR擴增反應程序為：94 ℃ 預變性 5 min，94 ℃ 變性 35 s，退火 35 s，72 ℃ 復性 90 s，35 個循環；72 ℃ 延伸 10 min，16 ℃保存。PCR擴增產物進行質量分數為1.0%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3 SCoT 引物合成、篩選與擴增 參照 COLLARD 等[8]設計 SCoT 引物，并由南京金斯瑞生物技術有限公司合成。引物篩選先利用1個樣品對55條SCoT引物進行初步篩選，選擇條帶清晰的引物，再利用性狀差異較大的3個朱頂紅樣品進行復篩，選擇條帶清晰、具多態性條帶的引物進行后續41份朱頂紅樣品的SCoT-PCR擴增。SCoT-PCR擴增反應程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性35 s，退火35 s，72 ℃復性90 s，36個循環，72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。PCR擴增產物用質量分數為1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表 1 41 個朱頂紅品種性狀描述Table 1 Character description of 41 H. rutilum cultivars used in this stduy

表 2 正交實驗因素及水平Table 2 factors and levers of orthogonal design

表 2 正交實驗因素及水平Table 2 factors and levers of orthogonal design

水平因素 引物/(μmol·L?1) MgCl2/(mmol·L?1) DNA/ng dNTPs/(mmol·L?1) rTaq/(×16.67 nkat)1 0.1 1.5 30 0.1 0.50 2 0.2 2.0 40 0.2 0.75 3 0.3 2.5 50 0.3 1.00 4 0.4 3.0 60 0.4 1.25

表 3 朱頂紅 SCoT-PCR 正交試驗體系篩選Table 3 Screening of orthogonal systems

1.2.4 數據統計分析 由于引物與DNA結合點可由瓊脂糖凝膠電泳圖譜的條帶表示，因此，PCR電泳圖中的每個條帶就是1個位點。在數據統計時，記錄重復的DNA電泳條帶峰同一引物的擴增產物，遷移率相同的條帶記為“1”，沒有條帶記為“0”，并建立矩陣，只記錄易于辨認的條帶，排除模糊不清的條帶。利用Excel計算多態性條帶百分比(percentage of bands，PPB)。根據“1，0”矩陣并使用NTSYspc軟件計算遺傳距離和遺傳相似系數，依據SHAN程序按照非加權配對算術平均法(UPGMA)法構建朱頂紅樣品間的聚類圖。

2 結果與分析

2.1 DNA 質量濃度與質量檢測結果

采用改良CTAB法提取朱頂紅基因組DNA，經質量分數為1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，各泳道朱頂紅基因組DNA條帶清晰、亮度好(圖1)，點樣孔附近無雜質殘留，表明提取DNA完好，降解少；使用微量核酸測定儀檢測DNA質量濃度與純度，吸光度值D(260)/D(280)為1.88～2.00，表明提取的朱頂紅基因組DNA純度較高，雜質較少；經測定朱頂紅DNA質量濃度為80.0～896.2 mg·L?1，可滿足后續實驗要求。

圖 1 部分朱頂紅樣品 DNA 電泳圖Figure 1 DNA electrophoresis of some samples of H. rutilum

2.2 朱頂紅 SCoT-PCR 體系的建立

2.3 朱頂紅 SCoT 引物篩選

利用建立的SCoT體系從55條SCoT引物初篩出32條條帶多且清晰的引物(圖3)，再用3個花色差異較大的朱頂紅樣品(‘婚禮舞曲’‘紅獅’‘迷霧’)對32條SCoT引物進行復篩(圖4)，最終篩選到12條條帶清晰且多態性良好的SCoT引物，用于后續41份朱頂紅樣品SCoT- PCR擴增。

圖 2 SCoT 引物 P55 正交試驗篩選結果電泳圖Figure 2 Electrophoretic map of the results of orthogonal test with SCoT primer P55

圖 3 部分 SCoT 引物初篩圖Figure 3 Preliminary screening of SCoT primers

圖 4 部分 SCoT 引物復篩電泳圖Figure 4 Electrophoretic map of secondary screening using partial SCoT primers

2.4 朱頂紅SCoT-PCR擴增結果分析與多態性分析

利用12條引物對41個朱頂紅品種的DNA進行PCR擴增，產物分布在 200～3 000 bp，共擴增出89條清晰的條帶，每條引物擴增的條帶數為5～11條，其中，P56擴增條帶數最多，可達11條，多態性條帶11條；P5擴增條帶數最少為5條，多態性條帶4條，平均每條引物擴增條帶為7.42條。多態性條帶合計77條，平均每條引物可擴增出的多態性位點為6.42條，多態性比率為86.52%。多態性最高的引物是P32、P40和P56均達100%；而引物P12的多態性最低，僅有60%(表4)。以上結果表明：SCoT分子標記適用于朱頂紅的多態性位點的檢測，便于朱頂紅品種間的遺傳多樣性的分析。

表 4 SCoT 標記引物擴增結果Table 4 Amplification results of SCoT marker primers

2.5 朱頂紅遺傳多樣性分析

根據12條多態性良好的SCoT引物對41份朱頂紅樣品的擴增結果，使用NTSYspc軟件計算品種遺傳相似系數。41份朱頂紅品種間共獲得861個相似系數組成相似性矩陣，41份朱頂紅樣材料兩兩之間的相似系數為0.292 3～0.833 3，平均為0.498 4。其中，2號‘愛神’和3號‘冰后’相似系數最大(0.833 3)，表明兩者之間親緣關系較近；23號‘奇妙仙子’和41號‘迷霧’相似系數最小(0.292 3)，表明兩者之間親緣關系較遠，相差較大。

同時，對41份朱頂紅品種的遺傳相似系數進行統計分析，以0.054 1為間距，分成10組，分析基因相似系數的頻數條形圖(圖5)。大部分朱頂紅品種種間相似度集中在 0.400 7～0.563 2，數目為524個，所占比例為63.91%；剩下的基因相似系數在兩側呈不對稱分布。表明朱頂紅不同品種之間存在明顯差異，具有豐富的遺傳多樣性。對相似性最高的10對品種的瓣型花色進行比對可以發現：相似性高的品種間瓣型具有高度的一致性(100%)，而花色的一致性較低(40%)，說明朱頂紅在花色方面的遺傳多樣性更為豐富。

圖 5 基于 SCoT 標記的朱頂紅品種間遺傳相似系數頻數分布直方圖Figure 5 Histogram of number distribution of genetic similarity coefficient among red varieties based on SCoT markers

2.6 SCoT 聚類分析

利用NTSYS 2.1軟件中的非加權配對算術平均法(UPGMA)對41份朱頂紅品種進行聚類分析，構建分子系統樹(圖6)。由圖6可知：在遺傳相似系數的0.42處可以將41份朱頂紅品種劃分為2個大類，說明這2個類群之間有較為明顯的差異。第Ⅰ大類有34個品種，既有重瓣品種又有單瓣品種，第Ⅰ大類又分為4個小類，其中Ⅰa類中，白色的2號‘愛神’和3號‘冰后’聚在一起，橙紅色6號‘鬼魅’、8號‘快車’和紅色的7號‘黑天鵝’聚在一起；Ⅰb小類多為紅色系列，而且還有多個由白色和紅色形成的復色花，如4號‘焦點’、24號‘瑞貝卡’、25號‘世外桃源’和13號‘紅唇’；Ⅰc小類多為紅色繁殖類，其中白色的可能是品種變異的結果；Ⅰd小類中單瓣、白色的20號‘繡球’和紅色的22號‘奇跡’是重瓣、橙紅和白色組成的復色花(21號‘迎春’)的可能親本；第Ⅱ大類品種較為簡單，包括35號‘世界和平’、36號‘北極女神’、37號‘首映’、38號‘圣誕快樂’、39號‘清晨陽光’、40號‘超級黛絲’、41號‘迷霧’在內的7個品種(系)，除36號‘北極女神’和37號‘首映’為重瓣外，均為單瓣，且多為復色花。

圖 6 基于 SCoT 標記的 41 份朱頂紅品種聚類圖Figure 6 Cluster analysis charts of 41 vermilion red based on SCoT marker

3 討論與結論

朱頂紅是國際市場上常用的觀賞植物，其種間雜交育種技術極大地豐富了朱頂紅品種(系)，具有較高的經濟價值。但目前，朱頂紅品種改良和選育主要以傳統的雜交育種方式為主，從自然雜交、人工雜交的后代中分離優良性狀單株，通過2～3 α培育后鑒定花瓣性狀、花色等形態學特征，性狀不同于親本且具有穩定遺傳性狀的被認定為新品種。此類育種方法工作年限長且進展緩慢，無法區分真假雜交種，有極大可能面臨育種失敗的風險。

近年發展起來的SCoT分子標記技術兼具操作簡單、多態性高、遺傳信息豐富、成本低和引物通用性強等特點[21]，是一種分析物種遺傳多樣性和親緣關系有效的分子標記輔助育種技術，為植物種質鑒定和指紋圖譜構建等研究提供了新的技術手段；它可以排除外界環境帶來的表觀遺傳變化，從基因組水平真實反映材料的遺傳基礎與特征，從而快速判斷是否為新品種，極大地縮短育種年限，降低育種成本。SCoT標記技術已應用于園林植物育種中，如玫瑰Rosa rugosa雜交種后代早期選擇、遺傳多樣性和親緣關系分析等方面[21]。本研究應用12條SCoT引物對41份朱頂紅品種進行PCR擴增后均檢測到清晰的條帶，平均多態性條帶比率高達86.52%，品種間遺傳相似系數為0.292 3～0.834 3，與利用ISSR分子標記檢測61份朱頂紅品種間(遺傳相似系數為0.371 4～0.842 9)[6?7]的結果相比，本實驗的朱頂紅品種間的遺傳范圍更廣泛，遺傳多樣性更高，可為朱頂紅的新品種選育提供基礎。聚類結果表明：本研究的41個朱頂紅品種沒有完全按照花的瓣型，而是根據遺傳相似系數混合聚類，多數花色性狀相似品種被聚在一起，如第Ⅱ大類多為紅色和白色組成的復色花。這與張林等[6?7]利用ISSR標記對61個朱頂紅品種的聚類不太一致，可能是由于SCoT標記技術是一種能跟蹤性狀，并獲得與性狀相關目的基因的新型分子標記技術；利用SCoT標記技術還可以初步判斷可能的雜交親本，如Ⅰd小類中單瓣、白色的‘繡球’(20號)和紅色的‘奇跡’(22號)是重瓣，橙紅和白色組成的復色花(21號‘迎春’)的可能親本。此假設可以在后期分子水平實驗中進一步驗證。

本研究成功有效地利用SCoT標記技術研究了朱頂紅品種間的遺傳多樣性和對可能親本的鑒定。今后可從朱頂紅種質資源圃中選擇親緣關系較遠的可育品種作為親本，進行品種間雜交，培育花色豐富和花型多樣的朱頂紅新品種，進一步改良和選育朱頂紅的新品種。