胃癌組織中血管擬態生成及其臨床意義

戴佳文，吳健，尤小蘭，王元杰，趙小軍，程之逸，劉貴遠，黃傳江

（1.泰州市第三人民醫院，江蘇泰州225321；2.泰州市人民醫院，江蘇泰州225300）

世界范圍內，胃癌是第5大惡性腫瘤，是癌癥相關死亡的第3大原因[1]。全球每年新增胃癌100余萬例，其中40%發生在中國，且胃癌死亡事件也主要發生在中國[2]，嚴重威脅國人健康。以手術為主的綜合治療并沒有有效地改善進展期胃癌患者的預后，進展期胃癌的患者5年整體生存率不到30%[3]。近年來，靶向VEGF受體抑制內皮細胞依賴性血管生成的單克隆抗體已成為晚期胃癌患者挽救治療的重要途徑[4]。然而，靶向VEGF信號的藥物并未取得預期療效。胃癌組織中血管擬態（Vascular Mimicry,VM）樣結構的存在可能是抗內皮細胞依賴血管生成藥物治療失敗的重要機制[5]。探索胃癌組織中VM樣結構生成狀況及其對胃癌患者預后的影響，探尋胃癌治療的新靶點，對提高胃癌患者整體臨床療效具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料我們建立了泰州地區胃腸腫瘤生物樣本庫，從樣本庫中調取了2012年6月至2013年12月在江蘇省泰州市人民醫院胃腸外科進行胃癌根治手術患者的石蠟標本，按照病例納入及排除標準，最終入組130例。病例納入標準：（1）行D2胃癌根治達R0切除；（2）術前檢查無手術禁忌癥；（3）術后病理資料完整；（4）術后完成半年輔助化療；（5）臨床隨訪資料完整。排除標準：（1）術前接受過新輔助放化療；（2）姑息性手術；（3）伴有其他系統惡性患者；（4）合并嚴重基礎疾病患者。患者基線資料詳見表1，本組病例無圍手術期死亡及嚴重并發癥發生。根據術后病理結果，有化療指征的患者術后4周開始進行XELOX或FOLFOX方案化療，總療程6個月。自患者手術后出院即開始隨訪，至2019年12月本課題結束，臨床隨訪5年，共有73例（56.15%）發生轉移或復發，其中69例（53.08%）患者死亡，死亡最早在手術后5個月。

1.1.2 主要儀器與試劑LEICA全自動組織脫水機（ASP300，德國萊卡）；派斯杰多功能包埋機（BM450A中國常州）；LEICA切片機（RM2235，德國萊卡）；奧林巴斯顯微鏡（MPUS BX51，日本）；小鼠抗CD34單克隆抗體（一抗）（abcam公司,ab8536）；辣根過氧化物酶標記抗鼠/兔免疫球蛋白多聚體分子（二抗）（Dako公司）；3，3－二氨基聯苯胺四鹽酸鹽（DAB顯色劑，Dako公司）；透明液（北京九州柏林生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 CD34-PAS免疫組化雙重染色應用福爾馬林固定、石蠟包埋的組織進行免疫組化染色均。將蠟塊包埋的組織制成4μm厚度的切片。將切片在二甲苯中脫蠟，并在梯度乙醇中水化；3%的過氧化氫的甲醇溶液封閉10分鐘處理內源性過氧化物酶；磷酸鹽緩沖液洗滌切片3遍后在微波爐中在95°C下用檸檬酸鹽緩沖液預處理20分鐘進行抗原熱修復；在載玻片上滴加CD34一抗（1:200）4°C孵育過夜；磷酸鹽緩沖液沖洗3分鐘，甩干玻片后滴加二抗，濕盒內孵育30分鐘；磷酸鹽緩沖液再次沖洗3分鐘，甩干玻片后滴加DAB液（1:50）進行顯色，室溫孵育10min；DAB反應后，將切片用0.5%高碘酸溶液處理10分鐘，并用蒸餾水沖洗3次，持續3分鐘；Schiff溶液避光染色20分鐘；顯色后的切片充分水洗后放入蘇木素中染5分鐘后再次水洗，流水沖洗10分鐘；梯度酒精丙酮浸泡后蓋玻片蓋好。

1.2.2 CD34-PAS雙重染色的評估每個標本均進行CD34–PAS免疫組化染色3次，CD34陰性對照（省略一抗）其他操作步驟不變，陽性對照由CD34試劑供應商提供，所有切片由兩位主治醫師以上資深病理科醫生采用MPUS BX51顯微鏡讀片，獨立診斷完成。在CD34–PAS雙重染色中，VM陽性狀態表現為粘多糖圍成的通道樣結構，PAS染色陽性，但CD34陰性，管道內可見紅細胞。VM陰性狀態即組織中僅可見CD34陽性表達的內皮細胞依賴血管。

1.3 數據處理及統計方法所有數據應用SPSS16.0 統計軟件進行數據分析，計數資料比較采用χ2檢驗；計量資料用`x±s表示，采用獨立樣本t檢驗進行均數比較；采用Kaplan-Meier法進行生存分析，兩組患者生存率采用Log-rank法進行比較；采用Cox回歸模型法分析影響胃癌患者總生存期的危險因素。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 VM僅見于胃癌組織，胃粘膜組織中未見VM CD34-PAS免疫組化雙染顯示僅胃癌組織中存在VM樣結構，同一張胃癌組織切片中可見內皮細胞依賴性血管和VM，VM樣結構中及內皮細胞依賴性血管中均可見紅細胞。相應的胃粘膜組織中僅見內皮細胞依賴血管，未見VM樣結構。

2.2 胃癌組織中血管擬態生成與各臨床病理特征之間關系CD34-PAS雙重染色顯示130例胃癌患者中31例患者胃癌組織中VM陽性表達（23.85%）；其余99例為VM陰性（76.15%）。根據CD34-PAS免疫組化雙染結果，將患者分為VM陽性組（31例），VM陰性組（99例），分析VM生成與胃癌患臨床病理特征之間的關系，統計結果表明胃癌組織中VM生成與腫瘤大小、腫瘤分化程度，腫瘤侵襲深度、胃周淋巴結轉移狀態、TNM分期及脈管中有無癌栓均相關（P均＜0.05，見表1）。

表1胃癌組織中VM生成與病理特征之間關系

續表

2.3 胃癌組織VM生成對患者預后的影響

2.3.1 胃癌組織中VM生成對患者OS影響VM陰性組患者總生存時間48.28±1.64月（95%CI：45.06～51.50），VM陽性組患者總生存時間24.88±2.11月（95%CI：20.75～29.01），兩組OS差異有高度統計學意義（LogRank:Chi-squre=58.35,P<0.01，見圖1）。

2.3.2 胃癌組織中VM生成對患者DFS的影響VM陰性組患者無復發生存時間44.88±1.88月（95%CI：41.19～48.57），VM陽性組患者無復發生存時間19.26±1.78月（95%CI：15.76～22.75），兩組DFS差異有高度統計學意義（Log Rank:Chisqure=59.45，P<0.01，見圖2）。

圖1胃癌組織中VM生成對OS的影響

圖2胃癌組織中VM生成對DFS的影響

2.4 影響胃癌患者預后的單因素分析根據患者術后生存狀態，分為生存組及死亡組，比較各臨床病理參數及胃癌組織中VM生成與患者生存之間的關系。單因素生存分析顯示，年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、腫瘤分化、浸潤深度、胃周淋巴結轉移狀況、TNM分期、脈管內有無癌栓及VM生成狀態是影響本組患者預后的單因素（見表2）。

表2影響本組130例患者術后總體生存率的單因素分析

2.5 影響胃癌患者預后的多因素回歸分析多因素回歸分析結果顯示，腫瘤分期、VM生成、腫瘤分化、脈管內有無癌栓是影響本組患者預后的獨立預后因素（見表3）。

表3影響本組130例患者術后總體生存率的多因素回歸分析

3 討論

VM是指某些高度惡性腫瘤細胞通過自身變形模擬血管內皮細胞并與細胞外基質相互作用模仿血管壁結構形成可以運輸血液（血漿、紅細胞）的管道系統，從而重塑腫瘤微循環，并與宿主血管相連使腫瘤獲得血液供應的一種現象[6]。VM具有如下特點：形成的血管管道呈簇狀或圖案樣排列；管道內沒有血管內皮細胞襯墊覆蓋，免疫組化CD31/CD34染色陰性；被大量的層粘連蛋白、纖維粘連蛋白以及膠原蛋白等細胞外基質包繞，過碘酸-雪夫（Periodic Acid-Schiff，PAS）染色陽性[7]。VM是腫瘤經典血液供應的重要補充，可以為腫瘤組織提供更多的血液供應，對內皮依賴性血管是腫瘤唯一血液供應方式的傳統觀念提出了挑戰。同時，VM的存在解釋了抗血管生成靶向藥物療效不如預期的原因[5]。

1999年，Maniotis等[7]在黑素瘤中發現并定義了VM，繼而更多學者在多種惡性腫瘤中均發現了此類內有紅細胞但沒有內皮細胞的管道樣結構。VM為快速生長的腫瘤提供必需的營養物質，促進腫瘤生長，并且基于VM缺乏內皮結構，通過滲漏作用增加腫瘤灌注。此外，已有研究發現VM與內皮細胞依賴血管相通[8]，促進腫瘤細胞進入血液循環，導致轉移。VM樣結構因缺乏內皮細胞，所以靶向內皮細胞的抗血管生成藥物對其作用甚微。甚至有研究[8]發現，抗血管生成治療使血管密度下降，導致組織乏氧，而乏氧環境促進了VM的形成，加速腫瘤進程。目前有關胃癌VM生成，以及VM在胃癌預后評估中的預測價值的報道甚少，通過檢查胃癌組織中VM生成，探尋血管擬態與各臨床病理參數及患者術后生存之間的關系，分析VM在胃癌預后評估中的預測價值，將為胃癌預后評估提供一個全新的方法。

本研究通過CD34-PAS免疫組化雙染發現VM僅在胃癌組織中表達，胃粘膜組織中檢測未發現VM，進一步佐證了VM生成與腫瘤惡性生物學行為之間的關系。本研究中，我們檢查了130例胃癌患者胃癌組織標本，其中31例（23.85%）VM陽性，且VM的發生率隨著胃癌進展而增加。胃癌VM生成與與腫瘤大小、腫瘤分化程度，腫瘤侵襲深度，TNM分期，胃周淋巴結轉移及脈管中有無癌栓均相關，表明胃癌組織中VM生成預示患者不良預后。然而，胃癌組織中VM生成對胃癌患者術后總體生存率的影響仍存在爭議，既往一項研究報道，胃癌組織中VM生成與胃癌患者的預后沒有密切關系[9]。本研究通過對患者術后5年的隨訪分析發現，胃癌組織中VM陰性患者的5年總體生存率及無病生存率均顯著高于VM陽性組患者。在進一步的研究中，我們分析了影響本組130例患者術后總體生存的單因素。單因素生存分析顯示，患者年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、腫瘤分化、浸潤深度、胃周淋巴結轉移狀況、TNM分期、脈管內有無癌栓及VM生成是影響本組患者預后的因素。眾所周知，腫瘤大小、腫瘤分化、浸潤深度、胃周淋巴結轉移狀況、TNM分期、脈管內有無癌栓等為胃癌預后不良因素，而腫瘤的位置及患者年齡與預后的影響未見類似報道。然而，多因素回歸分析結果表明胃癌患者TNM分期、腫瘤分化、脈管內有無癌栓及VM生成狀況是影響本組患者術后總體生存率的獨立預后因素。胃癌VM生成預示著腫瘤細胞的高侵襲性，與腫瘤的復發進展密切相關，這與既往研究結果一致[10]。

總之，胃癌組織中VM生成是胃癌患者預后不良的一項重要指標。臨床檢測胃癌組織中VM生成狀況，有利于患者預后評估，指導患者臨床治療。此外，進一步探尋胃癌組織中VM生成機制，為胃癌術后綜合治療提供全新的靶點，有望提高胃癌患者術后整體療效，提高進展期胃癌患者總體生存率。