雙濃度聯合改良碳青霉烯滅活試驗篩查CRE的臨床應用價值

李世榮， 林怡菁， 蔣曉飛， 關 明

（復旦大學附屬華山醫院檢驗科，上海 200040）

碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌（carbapenemresistantEnterobacteriaceae，CRE）是指對任何一種碳青霉烯類抗菌藥物（厄他培南、多尼培南、亞胺培南、美羅培南）耐藥或能夠產碳青霉烯酶的腸桿菌科細菌[1]。CRE是醫院感染常見的病原菌之一，在全球范圍內的定植率和感染率呈逐年上升趨勢，已成為全球性的公共衛生問題[2]。CRE的定植常先于CRE的感染或與感染并存，對入院患者進行CRE的主動篩查并對陽性患者采取一定的措施是預防CRE感染與傳播的有效途徑。本研究采用雙濃度聯合改良碳青霉烯滅活試驗（modified carbapenem inactivation method，mCIM）對231株腸桿菌科細菌臨床分離株進行CRE的篩查，并與VITEK 2 Compact自動化鑒定藥敏儀的檢測結果進行對比分析，評價雙濃度聯合mCIM篩查CRE的臨床應用價值。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集2018年10月—2019年8月華山醫院231株腸桿菌科細菌非重復（剔除同一患者同次住院第二次分離到的同種菌屬）臨床分離株，其中肺炎克雷伯菌183株、大腸埃希菌32株、陰溝腸桿菌13株、弗氏枸櫞酸桿菌2株、產酸克雷伯菌1株。

1.2 儀器和試劑

M-H瓊脂、血瓊脂平板和抗菌藥物紙片（英國Oxoid公司），VITEK 2 Compact自動化鑒定藥敏儀、GN革蘭陰性細菌鑒定卡和AST-N335革蘭陰性細菌藥物敏感性試驗卡（法國生物梅里埃公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定 病原菌分離嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》（第4版）進行，細菌鑒定采用VITEK 2 Compact自動化鑒定藥敏儀。質控菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）、肺炎克雷伯菌（BAA 1705）、肺炎克雷伯菌（BAA 1706）、陰溝腸桿菌（ATCC 700323）、嗜麥芽窄食單胞菌（ATCC 17666）購自美國模式培養物集存庫（American type culture collection，ATCC）。肺炎克雷伯菌（BAA 1705）為產碳青酶烯酶陽性菌株，肺炎克雷伯菌（BAA 1706）為產碳青酶烯酶陰性菌株。肺炎克雷伯菌HS 11286經測序驗證為KPC陽性、絲氨酸碳青霉烯酶產生株。肺炎克雷伯菌17-w2-89，經測序驗證為IMP陽性、金屬β-內酰胺酶產生株。

1.3.2 雙濃度篩查法[3]取2支含5 mL TSB肉湯的試管，分別加入10 μL 和20 μL的美羅培南標準液1 mg/mL，終濃度分別為2 μg/mL和4 μg/mL，用1 μL接種環將待測菌株接種于以上2支試管中，35 ℃ CO2孵箱過夜。將2個濃度的培養液用1 μL接種環分別轉種于中國藍瓊脂平板，繼續孵育過夜，觀察中國藍平板中菌落生長情況以及菌落形態：2個濃度均不生長，則為CRE陰性；2個濃度均生長，為CRE陽性；2 μg/mL濃度生長、4 μg/mL濃度不生長，通過mCIM確認CRE。

1.3.3 mCIM （1）操作步驟。參照美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2019年版的操作標準，用1 μL接種環挑1滿環生長于血瓊脂平板上的過夜培養純待測菌落于2 mL TSB肉湯中，震蕩10～15 s，每管放入1張含10 μg美羅培南的無菌紙片，確認紙片浸沒于菌懸液中，35℃±2℃大氣環境孵育4 h±15 min。孵育結束立即用營養肉湯或0.9%氯化鈉溶液制備0.5麥氏濁度的大腸埃希菌（ATCC 25922）菌懸液（直接菌懸法），涂布于M-H平板中（菌懸液制備和平板涂布必須15 min內完成，干燥3～10 min），用10 μL接種環將美羅培南紙片從TSB肉湯中取出，將紙片貼于試管內壁，輕輕按壓以擠去紙片上多余水分，然后將紙片取出貼于已涂布有大腸埃希菌（ATCC 25922）的M-H平板上，35℃±2℃大氣環境孵育18～24 h，測量抑菌圈直徑。（2）判斷標準。美羅培南抑菌圈直徑為6～15 mm或直徑為16～18 mm但抑菌圈內有散在菌落時，為碳青酶烯酶陽性；抑菌圈直徑≥19 mm，為碳青酶烯酶陰性；抑菌圈直徑為16～18 mm或直徑為≥19 mm但抑菌圈內有散在菌落，無法判斷是否存在碳青酶烯酶，則為碳青酶烯酶不確定[3]。

1.3.4 乙二胺四乙酸改良碳青霉烯滅活試驗（ethylenediamine tetraacetic acid-modified carbapenem inactivation method，eCIM） （1）操作步驟。mCIM結果為陽性時，取第2支含2 mL TSB肉湯的試管，加入20 μL濃度為0.5 mol/L的乙二胺四乙酸溶液，乙二胺四乙酸最終濃度為5 mmol/L；余下步驟同mCIM。（2）判斷標準。eCIM與mCIM結果比較，美羅培南抑菌圈直徑相差≥5 mm為金屬β-內酰胺酶陽性；美羅培南抑菌圈直徑相差≤4 mm為金屬β-內酰胺酶陰性，待測菌株產絲氨酸碳青酶烯酶；忽略任何抑菌圈內的散在針尖樣菌落[3]。

2 結果

2.1 儀器分析結果

231株腸桿菌科細菌中，儀器鑒定出有52株對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥，根據CLSI給出的定義，即52株為CRE，陽性檢出率為22.5%。肺炎克雷伯菌（BAA 1705）為產碳青酶烯酶陽性菌株，肺炎克雷伯菌（BAA 1706）為產碳青酶烯酶陰性菌株。見表1。

表1 231株腸桿菌科細菌各種篩查方法的篩查結果

2.2 mCIM篩查結果

231株腸桿菌科細菌中mCIM篩出陽性菌株52株，陽性率為22.5%。其中1株陰溝腸桿菌和1株肺炎克雷伯菌儀器分析結果為CRE，而mCIM結果為陰性；1株肺炎克雷伯菌和1株大腸埃希菌mCIM陽性，而儀器分析結果為對碳青霉烯類抗菌藥物中介。以儀器分析結果為參考，mCIM符合率為98.3%，敏感性為96.3%，特異性為98.9%。肺炎克雷伯菌（BAA 1705）mCIM陽性，肺炎克雷伯菌（BAA 1706）mCIM陰性。

2.3 雙濃度聯合mCIM篩查結果

231株腸桿菌科細菌中，2個濃度（2 μg/mL和4 μg/mL）均生長的有50株；2個濃度（2 μg/mL和4 μg/mL）均不生長的有172株；2 μg/mL生長而4 μg/mL不生長的有9株，對這9株菌繼續進行mCIM，篩出3株含有碳青霉烯酶，而另外6株碳青霉烯酶陰性。最后結果為：CRE陽性菌株53株，陰性菌株178株，陽性率為22.9%。以儀器分析結果為參考，符合率為98.7%，敏感性為98.1%，特異性為98.9%。

2.4 eCIM篩查結果

將mCIM試驗陽性的52株細菌繼續進行eCIM，結果顯示有13株eCIM陽性，即金屬酶在碳青霉烯酶中的陽性率為25%。

3 討論

腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的機制主要有：（1）產碳青霉烯酶，這是腸桿菌科細菌最常見的耐藥機制[4-5]。按照Ambler分子分類方法可將碳青霉烯酶分為A、B、D 3類，A類酶中的KPC，B類酶中的NDM、VIM和IMP，以及D類酶中的OXA-48是腸桿菌科細菌中最常見的碳青霉烯酶。A、D類碳青霉烯酶活性位點含絲氨酸殘基，故稱之為絲氨酸酶；B類碳青霉烯酶活性位點含1～2個Zn2+，故稱之為金屬β-內酰胺酶[6]。編碼碳青霉烯酶的基因常位于可移動的遺傳元件上，從而使其耐藥性極易在同種甚至異種菌株之間播散，造成感染的局部暴發和流行[7]。（2）產超廣譜β-內酰胺酶或產頭孢菌素酶合并外膜孔蛋白缺失或變異。（3）碳青霉烯類抗菌藥物的作用靶位發生改變。（4）細菌外排泵系統的改變。由外排泵和膜孔蛋白表達改變引起的細胞膜通透性改變可單獨或/和合并產超廣譜β-內酰胺酶引起腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥。RND外排泵中的AcrAB-TolC系統是腸桿菌科細菌對包括碳青霉烯類在內的多種抗菌藥物耐藥的主要機制之一。其中AcrAB突變、AraC調節子過表達等導致的外排泵表達增多，以及膜孔蛋白OmpK、OmpC、OmpF等的突變、缺失都可引起肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌等的碳青霉烯類最小抑菌濃度升高[8]。

本研究中，有1株陰溝腸桿菌和1株肺炎克雷伯菌儀器分析結果為CRE，而mCIM結果為陰性，提示這2株細菌有可能是非產碳青霉烯酶菌株，而是產超廣譜β-內酰胺酶或頭孢菌素酶合并外膜蛋白的缺失或變異，或者是碳青霉烯類抗菌藥物的作用靶位發生改變；另有1株肺炎克雷伯菌和1株大腸埃希菌mCIM結果為陽性，而儀器分析結果為對碳青霉烯類抗菌藥物中介，可能是所含碳青霉烯酶的活性比較低所致。

CRE是當前最受關注的耐藥威脅之一，我國CRE的流行情況也比較嚴重。全國細菌耐藥監測報告顯示，2018年肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率全國平均為10.1%，河南省最高（32.5%）[9]。因此，快速、準確地檢測耐藥菌是否產碳青霉烯酶，對于臨床治療和醫院感染控制至關重要。

Carba NP試驗是基于碳青霉烯酶對碳青霉烯類抗菌藥物β-內酰胺環的水解作用進行的比色檢驗，10 min～2 h就能觀測結果，但操作較為繁瑣，需要配制特定的試劑，并且對產OXA-48型碳青霉烯酶細菌的敏感性低[10-12]。聚合酶鏈反應最大的優點是速度快，可在數小時內得到結果，但也存在一些不足：只能對已知的編碼基因進行檢測，而對目前尚未發現的基因型無法進行檢測[13-14]；若細菌存在少見或未知的耐藥基因，則會導致碳青霉烯酶基因檢測結果呈假陰性；且價格昂貴，需要特定的設備，對操作人員有一定的技術要求；后續分析如藥物敏感性試驗仍需依賴傳統的培養方法等。

本研究采用雙濃度篩查法，先根據是否對碳青霉烯類耐藥將大部分的樣本分為陽性和陰性，不需要對每株細菌進行藥物敏感性試驗或者耐藥基因的檢測，大大減少了工作量。只對少部分在含2 μg/mL美羅培南的TSB肉湯中生長，而在4 μg/mL TSB肉湯中不生長的菌株通過mCIM確認是否含碳青霉烯酶，方便地篩查出CRE，與儀器分析結果的符合率為98.7%，敏感性為98.1%，特異性為98.9%，適用對直腸拭子或肛拭子樣本的篩查，操作簡便，無需特殊的試劑和儀器，適合在各級醫院的微生物實驗室中推廣使用，具有很大的應用價值。

本研究通過CLSI推薦的eCIM對52株mCIM陽性菌株進行碳青霉烯酶的快速分型，結果顯示，eCIM陽性菌株為13株，陽性率為25%。按照CLSI 2019版的標準給臨床報告eCIM陽性（產金屬β-內酰胺酶）或陰性（產絲氨酸酶），可為臨床用藥提供重要參考，頭孢他啶-阿維巴坦對金屬β-內酰胺酶無活性，但是對于絲氨酸碳青霉烯酶非常有效，所以對mCIM陽性菌株再進行eCIM非常必要，有利于臨床醫生精準用藥，減少產碳青霉烯酶菌株的院內流行，對于控制感染，提高患者生存率均有重要意義。