1個復合雜合突變導致的凝血因子Ⅺ缺陷癥家系表型及基因型分析

畢曉潔， 黃道超， 金先富， 姜俊宇， 蘇正仙， 陳超超， 沈 波

（1.溫州醫(yī)科大學附屬臺州醫(yī)院檢驗科，浙江 臨海 317000；2.溫州醫(yī)科大學附屬臺州醫(yī)院急診科，浙江 臨海 317000）

遺傳性凝血因子（coagulation factor，F(xiàn)）Ⅺ缺陷癥為罕見的常染色體隱性遺傳病，于1953年首次被ROSENTHAL等[1]報道，目前，突變類型已超過200多種（http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=F11），國外統(tǒng)計的發(fā)生率為1/500 000～1/1 000 000，不同發(fā)病率存在種族差異[2]。我國對于遺傳性FⅪ缺陷癥的報道較少，具體的致病機制也不是很明確。本研究對1例遺傳性FⅪ缺陷癥進行表型和基因型研究，探究其分子致病機制。

1 材料和方法

1.1 研究對象

1.1.1 家系資料 該家系共8人，包括先證者及父親、母親、姐姐、姐夫、外甥女、兒子、妻子。家系譜見圖1。先證者，男，36歲，因反復鼻衄入院。實驗室常規(guī)凝血功能檢查示：活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APPT）顯著延長，F(xiàn)Ⅺ活性（FⅪ：C）極低，D-二聚體（D-dimer，DD）輕度升高，其余指標均在參考區(qū)間內(nèi)。先證者肝、腎功能正常，未使用抗凝藥物。先證者父母非近親結婚，其他家系成員均無自發(fā)出血或血栓形成病史。

1.1.2 正常對照組 以140名體檢健康者作為正常對照組，其中男72名、女68名，年齡40（21～62）歲。無肝、腎疾病，無血栓或出血史。

圖1 遺傳性FⅪ缺陷癥家系圖

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 STA-R全自動血凝儀（法國STAGO公司）、AU5830全自動生化分析儀（美國雅培公司）、ABI Thermal cycler 2720 PCR擴增儀（美國ABI公司）、核酸蛋白分析儀（美國Beckman Coulter公司）、電泳儀（美國Bio-Rad公司）、凝膠成像系統(tǒng)（上海天能公司）。

1.2.2 試劑 凝血項目檢測試劑盒購自法國STAGO公司。DNA提取試劑盒、抗原檢測試劑盒及聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒均購自上海西塘生物科技技術公司。

1.2.3 引物 引物序列參考文獻[3]，由華大基因生物公司合成。

1.3 方法

1.3.1 標本采集和處理 采集所有受試者外周血，用0.109 mol/L枸櫞酸鈉1∶9抗凝。上層血漿用于凝血項目檢測；下層血細胞用于提取DNA，提取完成后置于-20 ℃冰箱保存待用。

1.3.2 凝血項目檢測 在全自動血凝分析儀上采用一期凝固法檢測凝血酶原時間（prothrombin time，PT）、APTT、纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)ib）、凝血酶時間（thrombin time，TT）、FⅡ活性（FⅡ∶C）、FⅤ活性（FⅤ∶C）、FⅦ活性（FⅦ∶C）、FⅧ活性（FⅧ∶C）、FⅨ活性（FⅨ∶C）、FⅩ活性（FⅩ∶C）、FⅪ活性（FⅪ∶C）及FⅫ活性（FⅫ∶C）；免疫比濁法檢測纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物[fibrin（fibrinogen）degradation product，F(xiàn)DP]、DD；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測FⅪ抗原（FⅪ∶Ag）水平。

1.3.3 抽提外周血基因組DNA 使用DNA提取試劑盒提取所有成員以及正常對照組外周血基因組DNA。

1.3.4 PCR擴增及電泳 PCR反應總體積為50 μL，其中DNA模板3 μL、PCR MaserMix 25 μL，雙蒸水18 μL，上、下游引物各2 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.3.5 DNA測序及分析 PCR產(chǎn)物進行直接測序，測序結果采用Chromas軟件與GenBank中的基因序列進行比對，發(fā)現(xiàn)突變后進行反向測序予以驗證。

1.3.6 生物學信息軟件分析 采用Mutation Taster（http：//www.mutationtaster.org）、PolyPhen-2（http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2）和SIFT（http：//sift.jcvi.org）3個在線生物信息軟件，通過評分預測突變位點對蛋白質(zhì)功能的影響。

2 結果

2.1 凝血指標檢測結果

先證者以及家系成員凝血功能檢測結果見表1。

2.2 基因分析結果

先證者F1 1基因1 1號外顯子存在c D N A.1 6 4 0 G＞A，1 4號外顯子存在cDNA.2183G＞A，導致Ala430Thr和Val611Met復合雜合突變。見表2、圖2和圖3。

表1 先證者及家系成員凝血指標檢測結果

表2 先證者及家系成員基因突變檢測結果

圖2 先證者及父親F11基因11號外顯子Ala430Thr突變及野生型

圖3 先證者、母親、兒子、姐姐F11基因14號外顯子Val611Met突變及野生型

2.3 生物學信息軟件分析結果

PolyPhen-2評分為1.00分，提示此突變?yōu)橛泻ν蛔儯籑utation Taster評分結果為disease causing，提示此突變可引起疾病；SIFT評分為0.10分，提示此突變可引起蛋白質(zhì)功能改變。

3 討論

FⅪ是一種絲氨酸蛋白酶原，相對分子質(zhì)量為16 000，在血漿中其主要與高分子量激肽原以非共價形式結合形成復合物[4]。編碼FⅪ的基因F11位于4號染色體長臂（4q35），共含有15個外顯子和14個內(nèi)含子，全長23 kb[5]，l號外顯子編碼的是5'端非轉錄區(qū)，2號外顯子編碼前導肽鏈，3-15號外顯子共編碼607個氨基酸分子，形成的FⅪ包括含有4個Apple結構域的重鏈以及1個胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶催化區(qū)的輕鏈。成熟的FⅪ分子含有2個相同單體，由2個殘基Cys321形成二硫鍵組成[6]。

根據(jù)經(jīng)典凝血瀑布學說原理，F(xiàn)Ⅺ在內(nèi)源性凝血途徑中發(fā)揮重要作用。FⅪ在凝血過程中被活化的FⅫ、凝血酶或自身裂解所激活，生成活化的FⅪ[7]，再通過一系列的凝血因子逐級活化過程，最終激活纖維蛋白原，形成纖維蛋白網(wǎng)，使血小板形成的團塊更加牢固[8]。FⅪ缺陷臨床表現(xiàn)多樣，突變基因雜合子的血漿FⅪ水平為正常人的30%～70%，而純合子的血漿FⅪ水平僅為正常人的0～20%[9]。該病患者無性別差異，與血友病A和B相比，出血癥狀相對較輕，且一般無自發(fā)性出血，出血常與創(chuàng)傷和手術相關[10]，因此疾病的診斷和治療都存在多變性。原因可能是FⅪ參與凝血過程的放大階段而不是影響凝血的起始階段，并且活化的血小板顆粒含有FⅪ，總活性得到一定的補償，因此FⅪ缺陷癥患者多數(shù)是在手術、創(chuàng)傷后才會表現(xiàn)出止凝血障礙[11]。而出血的嚴重程度常與累及的組織部位有關，原因是FⅪ還可引起凝血酶激活纖溶抑制物缺乏，因此在纖溶活性高的組織更容易出血，常見于黏膜[12]。

本研究中的先證者APTT延長至162 s，APTT糾正試驗可以糾正，排除因抑制物引起的獲得性凝血因子異常；FⅪ∶C為2%，F(xiàn)Ⅺ∶Ag為3.6%，活性與抗原成等比例下降，呈交叉反應物質(zhì)陰性特點。先證者父親、母親、姐姐及兒子均存在不同程度的FⅪ∶C和FⅪ∶Ag等降低。基因測序結果顯示，先證者F11基因的11號外顯子存在cDNA.1640G＞A，14號外顯子存在cDNA.2183G＞A，導致Ala430Thr和Val611Met復合雜合突變，分別來自于父親和母親，可以診斷為遺傳性FⅪ缺陷癥。

11～15號外顯子編碼的是多肽鏈的羧基端[14]，是1個胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶結構域，與FⅪ活化有關，發(fā)生在該區(qū)域的突變會導致空間構象產(chǎn)生變化，最終使多肽鏈的折疊發(fā)生異常，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性變差，極易被降解，F(xiàn)Ⅺ活化發(fā)生障礙。Ala430位于α螺旋結構內(nèi)部，丙氨酸被蘇氨酸替代后，與其周圍的Phe433和Tyr436空間位阻發(fā)生改變，α螺旋結構穩(wěn)定性變差[13]。該研究中患者FⅪ∶C為48.6%，F(xiàn)Ⅺ∶Ag為50%，無任何出血癥狀，與本研究先證者父親的表型類似，14號外顯子存在cDNA.2183G＞A，該突變是目前國際上發(fā)現(xiàn)的新的突變位點。611號纈氨酸突變?yōu)榧琢虬彼幔肿渔溩兌蹋c周圍氨基酸的作用力發(fā)生改變，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性變差。

綜上所述，Ala430Thr和Val611Met復合雜合突變是導致本例患者FⅪ∶C明顯下降的主要原因。但具體作用機制尚待進一步研究加以證實。