自噬在膜性腎病補體攻膜復合物所致足細胞損傷中的作用

吳洪鑾，安 寧，鐘 珍，李志航，劉偉敬，劉華鋒，楊 陳 （廣東醫科大學附屬醫院腎病研究所、湛江市慢性腎臟病防控重點實驗室，廣東湛江 524001）

原發性膜性腎病(pMN)是一種以蛋白尿為主要臨床表現的原發性腎小球疾病，約15%pMN患者在5～15 a內進展成終末期腎衰竭(ESDR)[1]。目前認為其發病機制之一是原位免疫復合物在腎小球上皮下沉積，激活補體系統，形成攻膜復合物C5b-9[2]。C5b-9作用于足細胞，導致足細胞產生足突融合、凋亡、增殖受限以及從腎小球基底膜上脫落等改變，引起腎小球濾過屏障結構和功能障礙，進而產生蛋白尿[3]。由此可見，C5b-9所致的足細胞損傷在pMN起始與進展中發揮重要作用，同時也說明足細胞是治療pMN的重要靶細胞。自噬是胞漿大分子物質和細胞器在膜包囊泡中降解的生物學過程，是一種廣泛存在于真核細胞中的生命現象。腎小球系膜細胞、足細胞、腎小球內皮細胞和腎小管上皮細胞等均保持一定程度的自噬以維持細胞本身的正常生理功能[4-8]。因此，進一步明確自噬在pMN足細胞損傷中所扮演的角色或許是今后pMN治療的另一突破口。本研究探討了自噬在C5b-9所致足細胞損傷中的作用，旨為膜性腎病尋找新的治療靶點提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 材料

MPC-5細胞株為永生化小鼠足細胞株，由廣東省人民醫院史偉教授贈送。RPMI 1640(Roswell Park Memorial Institute 1640) 培養基、胎牛血清、0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)、I型鼠尾膠原購于美國Gibco公司；γ-干擾素購于美國Millipore公司；乳酸脫氫酶(LDH)活性測定試劑盒購于美國BioVision公司；兔抗人C5b-9抗體、兔抗小鼠nephrin、兔抗小鼠podocin、兔抗小鼠LC3和兔抗小鼠Tubulin抗體購于美國Abcam公司；Alexa Fluor 488染料標記的驢抗兔IgG和鬼筆環肽(fluorescein phalloidin)購于美國Molecular Probes公司；抗熒光淬滅封片液4', 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購于中國碧云天公司；雷帕霉素(RAP)、氯喹(CQ)、二甲基亞砜(DMSO)和酵母多糖A(zymosan A)購于美國Sigma公司。其他試劑均購于國內外知名試劑公司。

1.2 酵母多糖活化血清(ZAS)的制備及刺激濃度的篩選[9]

0.15 mol/L氯化鈉配置1%的酵母多糖，雙蒸水煮沸1 h后冷卻至室溫，4 000 r/min離心30 min，棄上清，沉淀備用。無菌采集取正常志愿者血清，用0.8 μm濾器過濾，并于56 ℃熱滅活30 min，即得到熱滅活正常人血清(HIS)。將過濾后的未滅活血清以1:1的比例與酵母多糖混勻后37 ℃孵育1 h，1 2210 r/min 于4 ℃離心5 min，取上層血清，用0.8 μm濾器再次過濾后即可得酵母多糖活化血清(ZAS)。分別用含2%、4%、6%、8%、10%和12%ZAS的培養基在37 ℃培養細胞60 min，參考試劑盒說明書檢測其培養液上清LDH釋放率，尋找足細胞C5b-9亞溶破模型建立的最適ZAS濃度，并用免疫熒光檢測足細胞上C5b-9的表達情況，評價足細胞C5b-9亞溶解模型建立是否成功。同時根據實驗結果，選取含10%ZAS的培養液作用于MPC-5細胞，建立MPC-5 細胞C5b-9亞溶破模型[10]。

1.3 細胞培養和分組

用含10%(體積分數)胎牛血清、100 U/mL青鏈霉素以及10～ 50 U/mLγ-干擾素的RPMI 1640培養液在5% CO2、33 ℃條件下誘導MPC-5細胞增殖。待細胞生長至60%～70%融合時，轉入37 ℃培養箱、I型膠原鋪被的培養瓶中誘導其分化，培養基無需加入γ-干擾素。足細胞經8～12 d誘導后，用于后續分組：正常對照組(CON組)、10%酵母多糖活化血清刺激組(ZAS組)、ZAS+雷帕霉素組(ZAS+RAP組)、ZAS+氯喹組(ZAS+CQ組)、單獨雷帕霉素組(RAP組)及單獨氯喹組(CQ組)。CON組加入10%熱滅活后正常人血清(HIS)作對照，ZAS組加10%ZAS(含人C5b-9)進行刺激。雷帕霉素和氯喹的刺激終濃度均為10 μmol/L。

1.4 蛋白免疫印跡法檢測自噬標記蛋白LC3表達

用含苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液(radio immunoprecipitation assay lysis buffer)提取細胞蛋白，用BCA(bicinchoninic acid)定量蛋白濃度。將等量蛋白行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，而后濕轉法轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用含5%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液(PBS-T)封閉PVDF膜1 h后，加入兔抗小鼠LC3一抗或Tubulin一抗于4 ℃孵育過夜。PBS-T清洗后，加入HRP標記的驢抗兔IgG二抗孵育1 h。PVDF膜經清洗后，加入ECL發光液進行顯色，于Azure C500成像系統中觀察結果。

1.5 透射電子顯微鏡觀察足細胞自噬泡形成

將體外處理后的足細胞加入2.5%戊二醛混合固定液中，置于4 ℃固定24 h后，用1%鋨酸固定液再固定1～2 h；依次用50%、75%、90%和100%酒精進行脫水，每個濃度停留15～30 min；用氧化丙烯透明3次，每次10～15 min；氧化丙烯和Epon812工作液等量混合，對組織進行滲透；新鮮配制的Epon812固化塊逐漸加高溫度(不超過60 ℃)使之聚合變硬，包埋；切0.2～2 μm的半薄切片，以0.5%美蘭溶液染色5 min，光學顯微鏡定位觀察，之后將包埋塊切成表面積為0.3 mm×0.2 mm的錐體狀，用超薄切片機制成50～60 nm的超薄切片，并置于鎳網的火棉膠薄膜上，用醋酸鈾、檸檬酸鉛雙染色；最后在JEM-1400型電子顯微鏡下觀察足細胞自噬泡的形成情況。

1.6 直接免疫熒光法標記足細胞骨架蛋白F-actin的變化

將培養于蓋玻片上的足細胞用4%多聚甲醛于常溫固定10 min；PBS洗后用0.5% Triton X-100常溫通透5 min，PBS洗后，每張片加50 μL 100 nmol/L的鬼筆環肽，于濕盒避光常溫孵育30 min染色細胞骨架蛋白F-actin。PBS洗后，滴加DAPI染核5 min，滴加抗熒光淬滅封片液封片，于4 ℃避光保存。激光共聚焦顯微鏡下觀察并隨機采集5個視野(至少50個細胞)進行拍照。細胞內出現的顯示細胞輪廓的線狀熒光即細胞骨架的陽性染色。按細胞骨架的變化程度設立評分標準[11]，即正常(0分)、輕微變化(1分)、中度變化(2分)，嚴重變化(3分)。

1.7 間接免疫細胞熒光法檢測C5b-9的組裝及nephrin、podocin的表達

取出細胞爬片，用4%多聚甲醛在常溫下固定10 min；PBS沖洗后，加入0.5% TritonX-100穿透細胞膜10 min，用PBS沖洗后加入5%BSA封閉抗原60 min。而后滴加用2.5%BSA稀釋的兔抗人C5b-9、兔抗小鼠nephrin或兔抗小鼠podocin多克隆抗體，每次實驗均作空對照白(PBS代替一抗)和同型對照(兔/鼠血清或IgG亞型代替一抗)，濕盒內4 ℃孵育過夜后。次日用PBS洗后，滴加Alexa Fluor 488染料標記的驢抗兔IgG，37 ℃避光孵育60 min；PBS洗后，滴加DAPI 染核10 min，滴加抗熒光淬滅封片液。在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并隨機采集5個視野(至少25個細胞)進行拍照。評估C5b-9的組裝：在細胞膜上出現綠色針尖點樣、粗顆粒樣或片狀結構認為染色陽性。足細胞nephrin和podocin表達情況用Image J軟件進行定量分析，并進行組間比較。

1.8 統計學處理

應用SPSS 16.0軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，多個樣本比較采用單因素方差分析，方差齊時兩兩比較采用Bonferroni法，方差不齊時兩兩比較采用Tamhane’s T2法。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 亞溶解型C5b-9的刺激對足細胞自噬狀態的影響

如圖1所示，與CON組相比，ZAS刺激下足細胞內自噬標記蛋白LC3 II的表達顯著增加。透射電子顯微鏡下觀察發現，較之CON組，ZAS刺激下足細胞內自噬泡生成增多。

2.2 調節自噬對C5b-9亞溶破模型下足細胞骨架蛋白F-actin的影響

如圖2所示，與CON組比較，ZAS組細胞骨架結構明顯被破壞，細胞骨架極性消失，排列紊亂。與ZAS組比較，ZAS+CQ組的細胞骨架破壞程度更加明顯，細胞回縮，細胞骨架絲狀結構完全消失，極性消失，排列紊亂和稀疏；ZAS+RAP組的細胞骨架結構明顯改善，表現為排列較為有序、細胞極性有所保留。對各組MPC-5細胞的細胞骨架破壞程度進行評分，結果顯示亞溶解型C5b-9作用于足細胞造成細胞骨架明顯破壞(P＜0.01)；加入自噬抑制劑氯喹后能夠加重這種損害(P＜0.01)，而加入雷帕霉素則減輕C5b-9造成的細胞骨架異常變化(P＜0.01)。

2.3 調節自噬對C5b-9亞溶破模型下足細胞裂孔膜蛋白podocin和nephrin的影響

與CON組比較，ZAS組足細胞podocin和nephrin表達減少(P＜0.01)。與ZAS組比較，ZAS+CQ組足細胞podocin和nephrin表達量進一步減少(P＜0.01或0.05)，而加用雷帕霉素處理后能夠抑制ZAS刺激所致足細胞podocin和nephrin表達量的下降(P＜0.05或0.01)。見圖3、4。

3 討論

本研究通過體外建立足細胞C5b-9亞溶破損傷模型發現足細胞自噬相關蛋白LC3 II的表達升高，自噬泡生成增多，提示自噬活化參與其中。不僅如此，我們還發現抑制自噬進一步加重亞溶解型C5b-9所致足細胞骨架蛋白F-actin及裂孔蛋白podocin和nephrin的表達下調；而用雷帕霉素進一步激活自噬，則減輕C5b-9所致足細胞形態損傷變化。

圖1 亞溶解型C5b-9刺激下足細胞自噬蛋白LC3 Ⅱ的表達及自噬泡形成的變化

圖2 自噬調節對亞溶解型C5b-9所致MPC-5細胞骨架蛋白F-actin的影響

圖3 自噬調節對亞溶解型C5b-9所致MPC-5細胞podocin表達的影響

圖4 自噬調節對亞溶解型C5b-9所致MPC-5細胞nephrin表達的影響

pMN是較常見的一種腎小球疾病[12]，盡管其發病機制尚未完全闡明[13]，但是隨著研究的深入，目前認為，足細胞自身抗原與相應抗體結合所致的原位免疫復合物在其發病過程中起著重要作用。研究發現，這一免疫過程激活了補體系統，最終形成補體C5b-9攻膜復合物，C5b-9作用于足細胞，引起一系列病理生理改變，最終導致蛋白尿的產生及腎小球硬化等[2]。

相關研究指出，C5b-9損傷足細胞同時，也會引起足細胞內自我保護機制發揮作用[14-15]。因此，在找到抑制自身抗體的產生、徹底清除自身抗體抑或補體攻膜復合物沉積的方法之前，針對性地足細胞保護可能為pMN治療帶來新思路。

自噬是廣泛存在于真核細胞中的一種進化上高度保守、溶酶體調控的細胞內降解機制，其主要負責降解蛋白聚集體和損壞的細胞器以維持細胞的新陳代謝，與細胞的生長、分化、功能和存活密切相關。越來越多的研究發現：自噬參與人類的健康和多種疾病[16-17]。而目前自噬在腎臟疾病發生發展中的重要作用也越來越得到重視。研究報道，在生理狀態下，足細胞基礎自噬活性明顯高于其他腎臟固有細胞[4]，這足以讓我們相信足細胞內降解系統在維持細胞生理穩態中扮演著重要的角色。確實，有研究表明，足細胞自噬在腎臟損傷中起著保護性的作用并能延緩足細胞病(微小病變性腎病和局灶節段性腎小球硬化)的進展[18]。

為了解自噬如何參與補體攻膜復合物所致足細胞損傷，我們利用酵母多糖孵育正常人血清得到含C5b-9的活化血清ZAS。酵母多糖通過替代活化途徑激活補體系統，最終形成C5b-9攻膜復合物。在此亞溶解型C5b-9刺激體外模型中，足細胞內自噬相關蛋白LC3 Ⅱ表達升高，電子顯微鏡觀察到自噬泡有明顯的增加。因此，提示C5b-9所致足細胞損傷過程中，自噬可能被激活。

那么自噬活化是否起保護作用呢？抑或調控足細胞的自噬能否減輕C5b-9所致其損傷呢？為此，我們應用體外研究方法觀察，調節足細胞自噬水平能否加重抑或減輕C5b-9所致的足細胞骨架蛋白和裂孔蛋白的表達和分布異常。應用免疫熒光的方法檢測了各組足細胞骨架蛋白F-actin以及裂孔標志蛋白podocin和nephrin的表達。我們發現，在C5b-9刺激下，F-actin纖維絲失去平行排列形態，出現骨架蛋白塌陷，點狀或團塊狀聚集。而podocin和nephrin的表達下降且分布異常，提示足細胞發生形態損傷。在此基礎上利用溶酶體抑制劑氯喹抑制自噬通路后，F-actin團塊樣聚集進一步增加，podocin和nephrin表達進一步下降；這與既往研究，自噬缺陷或抑制自噬起始加重足細胞損傷的報道是一致的。而利用雷帕霉素激活自噬則能夠減輕上述損傷。既往報道雷帕霉素通過抑制mTOR激活自噬可以保護足細胞抵抗糖尿病狀態所致損傷。因此，自噬對C5b-9所致的足細胞的損傷是起保護作用的。

綜上所述，C5b-9可導致F-actin、podocin和nephrin表達異常或減少，引起足細胞損傷，而激活足細胞自噬可減輕補體攻膜復合物C5b-9所致的足細胞損傷。該研究發現為臨床上治療pMN及其他補體所致足細胞損傷腎小球疾病提供了新思路。