三七治療阿爾茨海默病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

孫天賜，李 雯，王登川 （廣東省深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院，廣東醫(yī)科大學(xué)附屬深圳龍華區(qū)中心醫(yī)院，廣東深圳 518110）

阿爾茨海默病(AD)是目前老年人死亡的第五大病因[1]，現(xiàn)有研究認(rèn)為遺傳、環(huán)境、代謝等多種因素共同作用是其發(fā)生的原因[2]。其發(fā)病機制包括β淀粉樣蛋白的沉積[3]、 tau蛋白異常過度磷酸化[4-5]、膽堿能損傷、興奮性氨基酸毒性和免疫炎癥反應(yīng)等等[6-8]。然而，除膽堿酯酶抑制劑以及非競爭性N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑(美金剛)外，仍無公認(rèn)的臨床新型抗阿爾茨海默病藥物[2]。近年的研究表明，傳統(tǒng)中藥三七對阿爾茨海默病具有良好的療效，但缺乏系統(tǒng)分析和機制的研究。因此，本研究選用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，基于系統(tǒng)生物學(xué)的角度研究三七防治AD的作用機理，為三七防治AD提供研究基礎(chǔ)，并為進(jìn)一步實驗驗證提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 三七所含化學(xué)成分的收集與整理

利用BATMAN-TCM(Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of TCM, http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php)，以SAN QI為檢 索詞，檢索三七的化學(xué)成分。

1.2 預(yù)測靶標(biāo)基因

利用BATMAN-TCM，以≥20分、P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選AD相關(guān)靶基因。

1.3 蛋白質(zhì)互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心基因分析

為探索靶點蛋白之間的相互作用，把三七治療AD的相關(guān)作用靶點上傳至STRING(https://stringdb.org/)，以置信度confidence score ＞0.4為參數(shù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。利用Cytoscape對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯鶕?jù)“中介中心性”(betweenness)降序排列，篩選核心基因。

1.4 靶點-成分網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

根據(jù)靶基因和有效成分的預(yù)測結(jié)果，使用Cytoscape軟件將篩選出的有效成分、潛在靶點構(gòu)建一個藥物-靶點網(wǎng)絡(luò)。在生成的網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點代表化合物、蛋白質(zhì)，線代表化合物-靶點相互作用。

1.5 GO生物過程與KEGG通路富集分析

將三七治療AD的相關(guān)作用靶點上傳至在線KOBAS3.0數(shù)據(jù)庫(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)，分析靶點的GO生物過程與KEGG通路。

2 結(jié)果

2.1 三七治療AD的靶點

三七治療AD的靶標(biāo)篩選檢索BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)三七治療AD的靶點共14個，與AD的經(jīng)典通路基本吻合(P＜0.05)，見表1。

2.2 三七治療AD的靶成分

三七活性成分篩選通過BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中整理出三七中共75個化合物，手動篩選三七治療AD的靶點對應(yīng)的成分共32個，見表2。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心基因分析

為了更好地清楚三七治療AD的作用機制，利用STRING軟件構(gòu)建了三七治療AD相關(guān)靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖1。PPI網(wǎng)絡(luò)中包含14個蛋白質(zhì)節(jié)點，47條相互作用關(guān)系(連線)，其中3個蛋白質(zhì)節(jié)點無相互作用關(guān)系。利用Cytoscape對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯鶕?jù)“中介中心性”(betweenness)降序排列，篩選前5位核心基因為乙酰膽堿酯酶(AChE)、α7神經(jīng)元尼古丁乙酰膽堿受體(CHRNA7)、毒蕈堿型膽堿受體M2(CHRM2)、絲氨酸水酶丁膽堿酯酶(BCHE)、脂蛋白E(APOE)。

2.4 靶點-成分網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

使用Cytoscape軟件構(gòu)建在治療AD方面三七活性成分-作用靶點的網(wǎng)絡(luò)模型，見圖2。從圖2中可以看出，32個主要活性成分的14個潛在靶點對比到AD上，且不同的活性成分可作用于相同的靶點，也可作用于不同的靶點，充分體現(xiàn)了三七多成分、多靶點的作用機制。其中與靶點相互作用關(guān)系最緊密(連線條數(shù)為4條)的有Ditertbutyl Phthalate(鄰苯二甲酸二叔丁酯)、1,22-Docosanediol(1,22-二十二碳二醇)、(-)-Dicentrine(左旋荷包牡丹堿)、1-Tetradecanol(1-十四醇)、1-Heptadecanol(1-十七烷醇)和N-Nonanol(1-壬醇)。

2.5 GO和KEGG通路分析

進(jìn)行GO分析，得到的候選靶標(biāo)具有的功能信息1 586條(P＜0.05)，按P值選取前10條(表3)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其功能多涉及膽堿能和突觸傳遞、β-淀粉樣結(jié)合、突觸信號傳遞、跨突觸信號傳遞、順行跨突觸信號、化學(xué)性突觸傳遞、銨離子結(jié)合、乙酰膽堿結(jié)合等方面。以P＜0.05進(jìn)行篩選，得到30條信號通路(如圖3)，其中排名前20的通路分別為膽堿能突觸、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、尼古丁成癮、鈣信號通路、化學(xué)致癌、AD、肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、PI3k-Akt信號通路、癌癥、代謝途徑、凋亡、色氨酸代謝、藥物代謝、內(nèi)分泌和其他因素調(diào)節(jié)的鈣再吸收、卵巢類固醇生成、脂肪細(xì)胞脂解的調(diào)節(jié)、VEGF信號通路、花生四烯酸代謝、利什曼病、補體與凝血級聯(lián)。其中膽堿能突觸、神經(jīng)活性配體-受體相互作用兩個途徑均有5個三七相關(guān)的靶基因富集。

表1 三七治療AD的靶點(≥20分)

表2 三七治療AD的靶成分

圖1 三七治療AD靶點蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖2 三七治療AD的靶點-成分網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

3 討論

AD是一種慢性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是老年期癡呆最常見的一種類型，早期癥狀表現(xiàn)為短期記憶喪失、失語、方向感下降，病程呈慢性進(jìn)行性，隨著疾病的發(fā)展，將嚴(yán)重影響社交、職業(yè)與生活功能，直至死亡[9-10]。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計，全球65歲以上老年人群AD患病率為4%～7%。平均年齡每增加6.1歲，患病率升高1倍，85歲以后患病率可高達(dá)20%～30%[3]。數(shù)據(jù)顯示，我國AD患病人數(shù)達(dá)500萬，60歲人群中患病率為5%，80歲為20%[11]。目前關(guān)于AD的病因和發(fā)病機制尚未完全闡明，也無特效治療方法可以逆轉(zhuǎn)或阻止AD的病情發(fā)展，因此在傳統(tǒng)中醫(yī)藥中進(jìn)行AD的研究，也是解決AD治療的重要途徑。

表3 三七治療AD的靶基因的GO分析

圖3 KEGG數(shù)據(jù)庫通路富集結(jié)果

AD在中醫(yī)學(xué)上屬于“呆病”范疇，在古代便有明代《景岳全書·癲狂癡呆》和清代陳士鐸《石室秘錄·呆病》分別以“速扶正氣為主”和“治痰即治呆”作為治法及方劑[12]。在20世紀(jì)初，“啟動于腎虛，進(jìn)展于痰瘀火，惡化于虛極毒盛”的病機假說和分期辨證施治方案的提出使得AD中醫(yī)診療進(jìn)一步規(guī)范[13-14]。2018年，AD中醫(yī)診療聯(lián)合共識小組達(dá)成的專家共識：AD早期以腎虛為主，應(yīng)以補腎為原則；中期痰瘀火并現(xiàn)，應(yīng)化痰、祛瘀、瀉火交替或并行；晚期因痰、瘀、火日久而化生毒濁所致，虛極毒盛，形神衰敗，需補腎固元，解毒化濁[12]。傳統(tǒng)中藥如三七、枸杞子、何首烏、巴戟天等有效成分能夠通過抗衰老、提高機體免疫、減輕神經(jīng)元損傷等作用改善老年癡呆動物相關(guān)癥狀[15]。

三七始載于《本草綱目》，具有散瘀止血、消腫定痛之功效，兼具抗炎、保肝、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛等作用。藥理學(xué)研究結(jié)果表明，三七具有抗凝血、心血管系統(tǒng)保護(hù)、腦組織和神經(jīng)保護(hù)以及腎臟保護(hù)等作用[16]。三七的主要活性成分三七總皂苷能顯著提高老年大鼠的學(xué)習(xí)及記憶能力，減少海馬神經(jīng)元凋亡[17]。臨床上應(yīng)用針刺配合三七等藥物治療老年癡呆癥，有效改善腦萎縮，對于促進(jìn)腦組織修復(fù)有一定作用[18]。三七皂苷具有改善學(xué)習(xí)記憶和治療AD方面的良好作用，作用機制主要涉及調(diào)節(jié)神經(jīng)可塑性、調(diào)節(jié)β淀粉樣蛋白Aβ代謝、抗細(xì)胞凋亡、抗氧自由基損傷、抗炎癥、改善膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能等方面[19]。

盡管前期臨床實踐及實驗研究表明，三七對AD具有良好的療效，但缺乏系統(tǒng)分析和機制的研究。因為中藥成分的多樣性，加之與人體相互作用的復(fù)雜性，進(jìn)行中藥治療疾病的潛在分子機制比較困難，但系統(tǒng)生物學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展也為明確中藥治療疾病的機制提供了可能性[20]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)正是這樣一門基于系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)，利用生物分子網(wǎng)絡(luò)分析方法，選取特定節(jié)點進(jìn)行新藥設(shè)計和靶點分析的藥理學(xué)分支學(xué)科[21-22]。中藥治療疾病往往是通過多條信號通路組成了復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)正是以“多基因、多靶點”的特點契合復(fù)雜疾病的治療理念，即通過闡述藥物-靶點-基因-疾病之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，進(jìn)行新藥研發(fā)和藥物作用機制研究。系統(tǒng)生物學(xué)的研究能直觀地揭示藥物發(fā)揮的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究為明確中藥和中藥復(fù)方治療疾病機制提供了可能性[20]。

本研究分析結(jié)果顯示，三七治療AD的作用靶點共14個，通過網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯?位核心靶點為ACHE、CHRNA7、CHRM2、BCHE、APOE。靶點-成分網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析結(jié)果顯示，32個主要活性成分的14個潛在靶點對比到AD上，且不同的活性成分可作用于相同的靶點，亦可作用于不同的靶點，充分體現(xiàn)了三七多成分、多靶點的作用機制。GO分析顯示，靶基因主要涉及膽堿能和突觸傳遞、β-淀粉樣結(jié)合等功能。KEGG通路分析顯示，靶基因主要與膽堿能突觸、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等通路相關(guān)。

通過三七有效成分篩選的5個AD核心靶點也確實在AD的發(fā)生發(fā)展和治療過程中發(fā)揮重要作用。海馬體和大腦皮層區(qū)域的乙酰膽堿(ACh)的水平對AD有直接影響，設(shè)計和合成廣泛的乙酰膽堿酯酶抑制劑(AChEIs)來控制ACh大腦的水平是治療AD的重要策略[23]。CHRNA7基因與多種認(rèn)知缺陷疾病如精神分裂癥、AD有遺傳聯(lián)系[24]。 Chee等[25]的研究表明，CHRM2基因與CHRM3基因中的SNP位點之間相互作用影響是誘發(fā)AD的風(fēng)險。而BChE，像AChE一樣，共同調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的代謝，是AD診斷和治療的靶點[26]。APOE是周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脂質(zhì)載體，APOE基因的ε4等位基因是晚期AD最強的遺傳危險因素[27]。

目前人們通過靶點-成分網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析，篩選出6個與靶點關(guān)系最緊密的活性成分：鄰苯二甲酸二叔丁酯、1,22-二十二碳二醇、左旋荷包牡丹堿、1-十四醇、1-十七烷醇和1-壬醇，但尚未見與AD相關(guān)的文獻(xiàn)報道。左旋荷包牡丹堿具有抗實驗性心律失常作用[28]，對冠狀動脈平滑肌的收縮有顯著的拮抗作用[29]， 并能抑制乙酰膽堿酯酶[30]，可能作為三七中起抗AD作用的主要成分之一。三七的主要有效成分三七皂苷多見于AD的治療研究，在BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中檢索發(fā)現(xiàn)其主要作用靶點為ATPA1，不是該系統(tǒng)中AD預(yù)測的主要靶基因。三七皂苷有可能通過調(diào)節(jié)ATPA1進(jìn)而影響AD相關(guān)靶基因的表達(dá)，當(dāng)然這需要進(jìn)一步的實驗驗證。

KEGG通路分析結(jié)果顯示，三七有效成分與AD的靶基因主要與膽堿能突觸和神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路相關(guān)。膽堿能突觸是AD的重要機制已經(jīng)得到公認(rèn)[31]，神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路與AD之間的相互作用關(guān)系也與文獻(xiàn)報道相符[32]。

綜上所述，三七治療AD主要作用于ACHE、CHRNA7、CHRM2、BCHE、APOE等靶點，并通過膽堿能突觸、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等通路發(fā)揮作用。本文對活性成分進(jìn)行分析篩選出6個與靶點最具相關(guān)性的成分，為AD的治療藥物分離純化提供了研究基礎(chǔ)。