骨內微血管顯影及三維重建在激素致大鼠股骨頭缺血性壞死模型中的應用

朱覺新，黃連芳 （廣東醫科大學廣東天然藥物研究與開發重點實驗室，廣東醫科大學海洋醫藥研究院，廣東湛江 524023）

股骨頭缺血性壞死(ANFH)是骨科門診的常見多發病，多見于長期、短期、間斷大量使用糖皮質激素[1]，應用糖皮質激素所引起的股骨頭缺血性壞死已為目前公認的事實，通過實驗室中建立的動物模型是研究激素性股骨頭缺血性壞死的重要手段之一。Micro-CT(微計算機斷層掃描技術)為一種新型的高清影像學技術，其分辨率極高，可達微米級，骨骼中骨小梁、微血管等微觀結構均能通過Micro-CT高分辨顯示[2]，對ANFH標本骨小梁、微血管等微結構變化具有極高的敏感性。

ANFH主要的骨形態改變表現為骨質連續性破壞和骨小梁形態異常，股骨頭壞死的生物應力可改變骨小梁的立體結構及空間排列，使其力學強度減弱，最終難以承重導致塌陷[5]。ANFH發生后，成骨細胞介導的新生骨生長和破骨細胞介導的壞死骨吸收同時出現[6]。隨著兩種作用的進展，骨內微觀結構尤其是骨小梁形態會發生不斷改變[7]。檢測和觀察股骨頭壞死病灶局部微觀結構動態變化的過程，是判斷病程進展、評價修復程度的重要方法，過去因缺少有效檢測方法而難以評價[8]。Micro-CT的出現，使對活體及離體骨組織微觀結構進行高清成像而不破壞內部結構成為可能[4]。本文旨在了解Micro-CT在大鼠激素性股骨頭缺血性壞死模型骨小梁和微血管三維結構觀察上的價值。

1 材料和方法

1.1 動物和分組

由廣東醫科大學實驗動物中心提供的清潔級SD大鼠共20只，分籠飼養，自由飲水。20只SD大鼠隨機分為實驗組和正常組，每組10只。

1.2 方法

實驗組進行ANFH造模：腹腔注射醋酸潑尼松龍24.5 mg/kg + 青霉素鈉14萬U/只，1周2次，連續注射8周[3]。對照組腹腔注射24.5 mL/kg生理鹽水 +14萬U/只青霉素鈉，1周2次，連續注射8周。8周內，兩組大鼠按正常方式喂養，飲水點設置高位，大鼠于飲水時直立，后肢完全負重。

每只大鼠分別于2、4、6、8周進行Micro-CT掃描，掃描部位為近端股骨頸以上至股骨頭末端，保持股骨長軸與掃描室切面垂直，設定掃描參數為掃描層面厚度20 μm，電流80 μA，球管電壓80 kV，電流500 μA，旋轉角度360°，旋轉角度增量0.4°，曝光時間2 960 ms，幀平均數為4，像素組合為1×1。掃描圖像原始尺寸：16.897 mm×13.442 mm×6.474 mm，圖像分辨率29 μm，圖像位數16位。采用Reconstruction Utility軟件行標本三維重建后，采用MicView V2.1.2三維重建處理軟件觀察標本結構，應用ABA專用骨骼分析軟件測量骨體積分數(BV/TV)、單位體積內骨小梁分支數目(Conn.Dens)、骨小梁數目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、結構模型指數(SMI)[4]。

1.3 統計學處理

2 結果

Micro-CT 掃描形態學觀察結果顯示：實驗組大鼠的股骨頭2周表現關節面邊緣模糊，軟骨面骨皮質厚度變薄，關節面下骨密度分布不均勻，軟骨下出現囊性樣改變，骨小梁稀疏、出現斷裂不連續、結構紊亂，骨小梁間隙變寬，微血管表現為部分血管萎縮、變細。第4周骨小梁進一步減少，骨小梁間隙進一步增加，皮質骨下部分區域出現骨缺損形成小空洞，微血管出現小部分中斷并且大部分出現血管萎縮。第6周骨質繼續減少，骨皮質邊緣不光滑，甚至有塌陷，皮質骨下空洞較之前更為擴大，骨小梁數目嚴重減少，微血管大部分出現中斷現象并且血管進一步萎縮。第8周股骨頭壞死嚴重，關節面有塌陷，關節面下出現較大骨缺損空洞，骨小梁變薄變稀疏，骨密度也嚴重下降，微血管不顯影。2、4、6、8周正常組與實驗組間的各項骨組織測量指標比較差異均有統計學意義(P＜0.01或0.05)，見表1。實驗組組內各時點兩兩比較的統計學處理結果見表2。

3 討論

ANFH是一種常見且發生后常不可逆轉的疾病，主要由股骨頭的逆行血液供應障礙導致的缺血缺氧性病理生理變化[9]。當股骨頭開始發生不可逆轉的缺血壞死時，其骨小梁也會相應地出現斷裂、缺失等變化，最終導致股骨頭的支撐能力減弱甚至塌陷、斷裂[10]。ANFH的具體病因還需分子生物學的進一步研究才能明了[11]，但有眾多危險因素最終可以導致骨組織缺血壞死的病理改變，如髖部外傷或手術、慢性酒精中毒、血液系統疾病及長期或不規律的激素治療等，這些危險因素的進展不但可能引致ANFN還可能繼發髖部骨關節炎等[12-13]。本研究對造模后2、4、6、8周的SD大鼠不同時段與正常SD大鼠進行Micro-CT檢測，觀察股骨頭微觀形態結構變化及進行計量學參數對比，不僅可以比較組間修復的差異，還能動態評價病灶修復進程。Micro-CT檢測結果顯示，自第2周開始實驗組股骨頭微觀結構逐漸開始破壞，微循環開始萎縮，至第8周已嚴重破壞，甚至微循環完全中斷。因此，Micro-CT在形態學的觀察上對于ANFN有明確的診斷意義。

表1 兩組大鼠頂部松質骨骨組織參數的比較 (±s，n=10)

表1 兩組大鼠頂部松質骨骨組織參數的比較 (±s，n=10)

與正常組同時點比較： a P＜0.01，bP＜0.05

組別正常組3 Conn.Dens/mm 1.54±0.15 1.48±0.17 1.55±0.25 1.57±0.22 BV/TV/(%)22.00±1.00 21.00±3.00 23.00±2.00 24.00±4.00 SMI 0.77±0.08 0.75±0.09 0.77±0.10 0.79±0.11 Tb.N/mm 1.14±0.12 1.15±0.23 1.12±0.24 1.19±0.25 Tb.Th/mm 0.20±0.03 0.18±0.04 0.21±0.07 0.17±0.11 Tb.Sp/mm 0.70±0.08 0.71±0.09 0.75±0.11 0.72±0.09實驗組2周4周6周8周2周4周6周8周18.00±2.00a 1.20±0.11a 1.08±0.39b 0.71±0.27a 0.16±0.01a 0.97±0.13a 16.00±2.00a 1.10±0.21a 1.11±0.25a 0.63±0.17a 0.14±0.01a 1.27±0.23a 15.00±1.00a 0.90±0.33a 1.39±0.19a 0.51±0.07a 0.10±0.01a 1.33±0.12a 13.00±2.00a 0.70±0.18a 1.55±0.59a 0.44±0.17a 0.06±0.01a 1.55±0.43a

表2 實驗組組內各時點間比較的P值

Micro-CT具有極強的空間成像分辨率的優點，能充分的顯露精確的解剖細節。另外，骨組織作為高密度組織在Micro-CT里有較高的對比度顯示[14]。目前使用 Micro-CT 在顯微骨組織形態的研究逐漸成為熱點，骨小梁是骨皮質在骨松質的延伸部分，空間結構各異且非均一，對其結構參數的精準測量有助于評判骨組織強度的大小[15]。本研究中，實驗組ANFH模型各周期與正常組比較差異均有統計學意義，提示通過Micro-CT檢測形態學觀察可以把握ANFH模型的動態變化，對ANFH模型有診斷意義，可以無創性的對骨形態進行微觀結構的觀察研究。

從本文表2的結果中可以看出，大多時點間的觀察指標差異均有統計學意義，特別是實驗組中各時點的Tb.Th差異均有統計學意義(P＜0.01)。各觀察指標在早中晚期的敏感程度均不一致，例如BV/TV在中期敏感度較低，4周vs6周間的差異無統計學意義(P＞0.05)，其余各時點比較差異均有統計學意義(P＜0.01或0.05)；Tb.Sp則是在中晚期不敏感，4周vs6周、4周vs8周、6周vs8周差異均無統計學意義(P＞0.05)，而其早期的指標差異均有統計學意義(P＜0.01)。因此，Micro-CT的各項量化指標在各觀察時點的敏感程度表現不一致，或許通過延長研究時間可以優化量化指標在ANFH的表現。

綜上所述，以亞納米級硫酸鋇為造影劑，Micro-CT動態觀察ANFH大鼠各周期骨形態結構變化，Micro-CT在形態學的觀察上對于ANFN有明確的診斷意義，可以無創性的對骨形態進行微觀結構的觀察研究，為ANFH的臨床研究提供新的研究方式以及量化指標。