microRNA—182在口腔鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)及對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

王飛飛　安晶紅　宋美

[摘要] 目的 檢測microRNA-182（miR-182）在口腔鱗癌組織中的表達(dá)，探討miR-182對口腔鱗癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。 方法 收集2015年7月～2016年10月哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院住院患者10例鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本和配對組織，實(shí)時熒光定量PCR方法檢測miR-182 mRNA在口腔鱗癌組織中的表達(dá)水平。培養(yǎng)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系TCA8113，分四組：空白對照組（Control組）、空載體組（Vehicle組）、陰性對照組（miR-182-NC組）和miR-182-inhibitor組（miR-182-i組）。利用MTT法和Transwell小室方法分別檢測TCA8113細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-182-inhibitor后的增殖和遷移能力的變化。 結(jié)果 口腔鱗癌組織與配對組織比較，miRNA-182的表達(dá)顯著增高（P < 0.05）。轉(zhuǎn)染miR-182-inhibitor后，miR-182-i組細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞遷移數(shù)顯著低于Control組、（P < 0.05）。 結(jié)論 miR-182的高表達(dá)可能與口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，下調(diào)miR-182的表達(dá)可抑制TCA8113細(xì)胞的增殖遷移能力，其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

[關(guān)鍵詞] 口腔鱗狀細(xì)胞癌；微小RNA；miRNA-182

[中圖分類號] R739 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）12（a）-0017-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of miRNA-182 （miR-182） in oral squamous cell carcinoma （OSCC） and explore the effects of miR-182 deficiency on proliferation and migration in OSCC cells. Methods 10 cases of OSCC samples and paired tissues were collected from Stomatological Hospital of Harbin Medical University from July 2015 to October 2016. The expression of miR-182 in OSCC tissues was detected by quantitative reverse-transcription polymerace chain reaction （RT-qPCR）. Culturing TCA8113 cells and separating the samples to four groups： Control， Vehicle， miR-182-NC and miR-182-i group. After transfection with miR-182 inhibitor， TCA8113 cell proliferation and migration were examined with MTT assay and Transwell assay. Results The level of miR-182 in OSCC samples was significantly higher than that in normal paired tissue group （P < 0.05）. The proliferation capability and migration capability in miR-182-i group were decreased than those in Control group （P < 0.05）. Conclusion The high expression of miR-182 may be correlated with the development of OSCC. Decreased the expression of miR-182 may inhibite OSCC cancer cell proliferation and migration. Further study should be conducted to explore the function of miR-182 in OSCC development.

[Key words] Oral squamous cell carcinoma； miRNA； miRNA-182

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是頭頸部較常見的惡性腫瘤，占所有口腔惡性腫瘤的70%～90%，是頭部和頸部癌癥患者發(fā)病和死亡的主要原因[1]。近二十年，雖然診斷技術(shù)和治療手段不斷提高和完善，口腔癌的發(fā)病率有所下降，但治療效果仍然不佳，僅5%患者的總體生存期有所改善，且5年生存率只有50%，局部復(fù)發(fā)率和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移率都高達(dá)25%[2-3]。目前口腔腫瘤的主要治療方式為手術(shù)切除和放化療，尤其放化療后患者生存質(zhì)量明顯下降，常造成毀容和致殘，因此口腔腫瘤的早期診斷和深入的發(fā)病機(jī)制研究對于患者的治療和預(yù)后具有重要意義[4-5]。所有癌癥的發(fā)生和發(fā)展，包括口腔腫瘤，都與某些抑癌基因或致癌基因的表達(dá)異常密切相關(guān)[6]。MicroRNA（miRNA）是近年來發(fā)現(xiàn)的廣泛存在于真核生物中，序列高度保守的由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和存活等多種生命過程的調(diào)節(jié)[7]。microRNA-182（miR-182）屬于miR-183/96/182簇的一員，具有高度同源的microRNA序列，在各物種間高度保守。有研究者對已發(fā)表的49篇文獻(xiàn)進(jìn)行綜合分析，結(jié)果顯示miR-182在15種腫瘤組織中表達(dá)升高，其中包括直腸癌、前列腺癌、肺癌等，并對其下游的靶基因進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)大部分是腫瘤相關(guān)基因[8-9]。而miR-182與口腔腫瘤的關(guān)系相關(guān)報道甚少。本實(shí)驗(yàn)通過對口腔腫瘤組織中miR-182 mRNA表達(dá)水平的檢測，觀察miR-182對口腔鱗癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，探討其在口腔癌中發(fā)生、發(fā)展過程中可能的作用機(jī)制，為將來其作為分子標(biāo)志或藥物靶點(diǎn)提供思路和科學(xué)線索。endprint

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本 選擇2015年7月～2016年10月于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院頜面外科接受手術(shù)治療的OSCC患者10例，均經(jīng)病理確診。癌旁正常組織定義為病灶周圍病理檢查未見OSCC細(xì)胞的組織。患者平均年齡為（49.25±9.64）歲，其中，男6例，女4例。所有患者均簽署知情同意書。所有患者術(shù)前均未接受過放療或化療。組織提取后置于-70°C低溫冰箱中保存，備用。

1.1.2 細(xì)胞系 人舌鱗癌細(xì)胞系TCA8113，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 試劑 RPMI-1640購自Gibco公司；胎牛血清購自Gibco公司；miR-182-inhibitor購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司；MTT試劑盒購自Sigma公司。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 倒置顯微鏡購自O(shè)lympus 公司，酶標(biāo)儀購自Labsystems Ascent公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人口腔癌TCA8113細(xì)胞株用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37°C、5%飽和濕度的恒溫密閉CO2培養(yǎng)箱。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長。用胰酶消化細(xì)胞，每3天傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時熒光定量PCR Trizol法提取口腔鱗癌組織中總RNA，測量OD260/OD280值均在1.8～2.0之間，提取后儲存于RNA保存液，后溶于DEPC水中，保存于-70°C低溫冰箱。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，反應(yīng)使用SYBY green 1作為熒光檢測信號。Real-Time RT-PCR所用引物如下：上游5′-GT？鄄GCGGTTTGGCAATGGTAGAAC-3′，下游5′-CCAGTGCA？鄄GGGTCCGAGGT-3′。運(yùn)用SYBR Prime Script RT-PCR Kit定量擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)總體積10 μL：cDNA 1 μL，引物 0.4 μL，SYBR Primix Ex TaqTM 5 μL，加RNase H2O至10 μL。實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)程序條件設(shè)置為：94°C預(yù)變性15 min，94°C 30 s，55°C 50 s，70°C 45 s，進(jìn)行30個循環(huán)。以RNA U6為內(nèi)參，每個樣品均設(shè)置3個復(fù)孔，目標(biāo)基因的相對定量采用2-ΔΔct計算。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖率 收集處于對數(shù)生長期的TCA8113細(xì)胞，制成濃度為4×104個/mL的細(xì)胞懸液，于96孔培養(yǎng)板內(nèi)每孔加入200 μL細(xì)胞懸液，制作通過瞬時轉(zhuǎn)染miR-182 inhibitor抑制miR-182表達(dá)的實(shí)驗(yàn)組模型。實(shí)驗(yàn)分四組：空白對照組（Control）、空載體組（Vehicle）、陰性對照組（miR-182-NC）和miR-182-inhibitor組（miR-182-i）。轉(zhuǎn)染時間分別為24、36、48、60、72 h，每孔加入MTT試劑20 μL，4 h后終止培養(yǎng)，棄上清加入DMSO。按照試劑盒說明書操作，記錄酶標(biāo)儀490 nm處吸光值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以吸光度為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.2.4 Transwell法檢測細(xì)胞遷移 實(shí)驗(yàn)組miR-182 inhibitor轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，胰酶消化制作細(xì)胞懸液密度為2×105個/mL。將100 μL無血清培養(yǎng)基稀釋的細(xì)胞懸液接種于Transwell小室的上室，下室加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS沖洗2次，甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色25 min，倒置顯微鏡觀察遷移至小室下層的細(xì)胞個數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Minitab 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-182表達(dá)水平檢測

Real-Time RT-PCR結(jié)果顯示，鱗癌組織中miR-182的表達(dá)水平明顯高于正常癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖1。

2.2 細(xì)胞增殖能力檢測

結(jié)果顯示，miR-182-i組轉(zhuǎn)染miR-182-inhibitor后，TCA8113細(xì)胞在36、48、60、72 h處的增殖率顯著低于Control組（P < 0.05），而Vehicle組、miR-182-NC組與Control組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖2。

2.3 細(xì)胞遷移能力檢測

結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-182-inhibitor后miR-182-i組TCA8113細(xì)胞的遷移數(shù)個數(shù)為（35.5±7.3），Control組為（51.3±5.2），Vehicle組為（56.2±7.2），miR-182-NC組為（52.7±6.4），miR-182-i組的細(xì)胞遷移率明顯低于Control組（P < 0.05），Vehicle組、miR-182-NC組與Control組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖3。

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，盡管miRNA占人類基因組不到1%，卻在機(jī)體的生理調(diào)控過程中起著至關(guān)重要的作用，調(diào)控人類約1/3基因的表達(dá)。miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控受到廣泛關(guān)注[10-11]，越來越多的證據(jù)表明miRNA在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著癌基因或抑癌基因的作用，既參與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，又可抑制惡性腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移，在腫瘤細(xì)胞的各種代謝和活動中發(fā)揮重要作用。

2003年首次發(fā)現(xiàn)miR-182，定位于人7號染色體，與miR-96、miR-183形成一個基因簇[12]。miR-182的異常表達(dá)可能參與了很多疾病的發(fā)生發(fā)展，如腫瘤、自身免疫性疾病、抑郁癥、代謝性疾病等。近年來，大量研究證實(shí)，miR-182參與多種惡性腫瘤的進(jìn)程，如消化道腫瘤、肺癌、膠質(zhì)瘤等，但研究發(fā)現(xiàn)miR-182的作用機(jī)制復(fù)雜，在某些惡性腫瘤中起著抑癌基因的作用，抑制腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移能力，而在某些惡性腫瘤中卻又起著促癌基因的作用，高表達(dá)并增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[13-16]。endprint

OSCC是頭頸部常見的惡性腫瘤，目前的治療方法主要是手術(shù)切除和放化療，術(shù)后復(fù)發(fā)率及顏面部的功能損傷使治療效果不讓人滿意[17-19]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，尋找分子生物治療也許會給OSCC的治療提供新的思路[20]。本實(shí)驗(yàn)通過檢測OSCC組織和配對正常組織中miR-182的含量發(fā)現(xiàn)，口腔鱗癌組織中miR-182表達(dá)高于正常配對組織，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究所選10例臨床標(biāo)本中，其中8組配對標(biāo)本miR-182的表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)組顯著高于對照組，一組表達(dá)實(shí)驗(yàn)組表達(dá)水平略低于對照組，一組表達(dá)水平相同，均為低水平表達(dá)。由于本實(shí)驗(yàn)的樣本量有限，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計中，應(yīng)增加樣本量一步驗(yàn)證miR-182在OSCC組織中的表達(dá)情況。

增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-182-inhibitor后TCA8113細(xì)胞的增殖能力與Control組相比，在各時間點(diǎn)均降低，而Vehicle組、miR-182-NC組與Control組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示miR-182-inhibitor可顯著抑制TCA8113細(xì)胞增殖能力，因此推斷在OSCC細(xì)胞中，miR-182可能有助于腫瘤細(xì)胞的增殖，起到癌基因的作用。為了研究miR-182對口腔癌細(xì)胞的侵襲能力的影響，Transwell小室檢測結(jié)果顯示TCA8113細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-182 inhibitor后，miR-182-i組細(xì)胞穿透基質(zhì)膠進(jìn)入到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯少于Control組，而其他三組Control組、Vehicle組和miR-182-NC組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示沉默miR-182后TCA8113細(xì)胞的遷移能力顯著降低，miR-182與OSCC腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，miR-182可以增強(qiáng)OSCC細(xì)胞的侵襲能力。

綜上所述，miR-182在OSCC組織中表達(dá)升高，沉默miR-182可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。miR-182在OSCC腫瘤細(xì)胞中起著癌基因的作用，提高細(xì)胞的增殖和侵襲能力。本實(shí)驗(yàn)為miR-182作為OSCC的輔助診斷指標(biāo)以及預(yù)防治OSCC提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為OSCC的生物治療提供理論基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Lawal AO，Adisa AO，Effiom OA. A review of 640 Oral squamous cell carcinoma cases in Nigeria [J]. J Clin Exp Dent，2015，9（6）：e767-e771.

[2] Minhas S，Kashif M，Altaf W，et al. Concomitant-chemoradiotherapy-associated oral lesions in patients with oral squamous-cell carcinoma [J]. Cancer Biol Med，2017，14（2）：176-182.

[3] Pierre CS，Dassonville O，Chamorey E，et al. Long-term functional outcomes and quality of life after oncologic surgery and microvascular reconstruction in patients with oral or oropharyngeal cancer [J]. Acta Otolaryngol，2014， 134（10）：1086-1093.

[4] Nao EE，Dassonville O，Poissonnet G，et al. Ablative surgery and free flap reconstruction for elderly patients with oral or oropharyngeal cancer： oncologic and functional outcomes [J]. Acta Otolaryngol，201，131（10）：1104-1109.

[5] Tirelli G，Zacchigna S，Biasotto M，et al. Open questions and novel concepts in oral cancer surgery [J]. Eur Arch Otorhinolaryngol，2016，273（8）：1975-1985.

[6] Lin N，Lin Y，F(xiàn)u X，et al. MicroRNAs as a Novel Class of Diagnostic Biomarkers in Detection of Oral Carcinoma：a Meta-Analysis Study [J]. Clin Lab，2016，2（3）：451-61.

[7] Murugan AK，Munirajan AK，Alzahrani AS. MicroRNAs：Modulators of the Ras Oncogenes in Oral Cancer [J]. J Cell Physiol，2016，231（7）：1424-1431.

[8] Tang L，Chen F，Pang EJ，et al. MicroRNA-182 inhibits proliferation through targeting oncogenic ANUBL1 in gastric cancer [J]. Oncol Rep，2015，33（4）：1707-1716.

[9] Gao Y，Zhao H，Lu Y，et al. MicroRNAs as potential diagnostic biomarkers in renal cell carcinoma [J]. Tumour Biol，2014，35（11）：11041-11050.endprint

[10] Kong YW，F(xiàn)erland-McCollough D，Jackson TJ，et al. micro-RNAs in cancer management [J]. Lancet Oncol，2012， 13（6）：e249-e258.

[11] Lopez-Camarillo C，Marchat LA，Arechaga-Ocampo E，et al. MetastamiRs：non-coding microRNAs driving cancer invasion and metastasis[J]. Int J Mol Sci，2012，13（2）：1347-1379.

[12] Lagos-Quintana M，Rauhut R，Meyer J，et al. New microRNAs from mouse and human [J]. RNA，2003，9（2）：175-179.

[13] Jin ZB，Hirokawa G，Gui L，et al. Targeted deletion of miR-182，an abundant retinal microRNA [J]. Mol Vis，2009，15（1）：523-533.

[14] Wang CG，Ren R，Hu HL，et al. MiR-182 is up-regulated and targeting Cebpa in hepatocellular carcinoma [J]. Chin J Cancer Res，2014，26（1）：17-29.

[15] Zhang L，Liu T，Huang Y，et al. MicroRNA-182 inhibits the proliferation and invasion of human lung adenocarcinoma cells through its effect on human cortical actin-as-sociated protein [J]. Int J Mol Med，2011，28（3）：381-388.

[16] Kouri FM，Hurley LA，Daniel WL，et al. MiR-182 in- tegrates apoptosis，growth，and differentiation programs in glioblastoma [J]. Genes Dev，2015，29（7）：732-745.

[17] Gomes CC，Gomez RS. MicroRNA and oral cancer： future perspectives [J]. Oral Oncol，2008，44（10）：910-914.

[18] Dong N，Wang W，Tian J，et al. MicroRNA-182？prevents vascular smooth muscle cell dedifferentiation via FGF9/PDGFRβ signaling [J]. Int J Mol Med，2017，39（4）：791-798.

[19] Sritippho T，Chotjumlong P，Iamaroon A. Roles of Human Papillomaviruses and p16 in Oral Cancer [J]. Asian Pac J Cancer Prev，2015，16（15）：6193-6200.

[20] 劉思玉，謝龍，祁兵，等.口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中差異微小RNA/mRNA表達(dá)譜的對接研究[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2014，32（4）：400-403.

（收稿日期：2017-09-01 本文編輯：程 銘）endprint