牦牛lncFAM200B的克隆鑒定、表達及生物信息學分析

趙麗玲，王 會，柴志欣，王吉坤，王嘉博，武志娟， 信金偉，鐘金城，姬秋梅

(1.西南民族大學 青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省、教育部重點實驗室，四川 成都 610041； 2.省部共建青稞和牦牛種質資源與遺傳改良國家重點實驗室，西藏 拉薩 850000)

牦牛(Bosgrunniens)作為高原地區的特有牛種，耐粗飼，抗病能力強，能夠在氧氣稀缺，氣候寒冷，牧草生長季短的高寒草地環境下生存繁衍[1]。牦牛獨特的生存環境使其肉質具有高蛋白和低脂肪的特點，但由于脂肪含量低，導致牦牛肉口感較差。因此，研究影響牦牛肌肉和脂肪發育的分子機制對改善牦牛肉品質具有重要意義。

lncRNA是一類長度大于200 nt且多數不具有蛋白編碼能力的RNAs[2]，其物種間保守性差，可在不同層面發揮調控作用，主要作用機制：參與基因印記[3]，通過染色質重塑[4]和組蛋白修飾[5]等方式從表觀遺傳水平調控基因表達；在轉錄水平，通過順式作用影響鄰近基因表達[6]，作為誘餌分子招募轉錄因子[7]或RNA聚合酶Ⅱ[8]從而促進或抑制基因表達；lncRNA可在轉錄后水平通過招募蛋白質或與miRNA結合，從而影響靶基因的可變剪接、mRNA穩定性以及翻譯過程[9-11]。Billerey等[12]采用RNA-seq技術在利木贊牛肌肉中鑒定出584個lncRNAs，預測這些lncRNAs在肌肉發育過程中起重要調控作用。Sun等[13]發現，lncMD與秦川牛骨骼肌分化相關，過表達lncMD促進肌細胞分化，抑制其表達則導致肌細胞分化相關標志基因MHC和MyoG表達量下降，進而影響肌肉發育。Li等[14]發現一個在胎牛和成年牛骨骼肌中差異表達的lncRNAMDNCR，MDNCR可通過吸附miR-133a促進牛成肌細胞分化并抑制細胞增殖。Chen等[6]研究發現，lncKBTBD10可通過影響其鄰近基因KBTBD10表達，參與牛骨骼肌形成過程。Liang等[11]構建了一個影響牛乳脂肪合成的lncRNA-miRNA-mRNA表達網絡，其中涉及41個lncRNA和11個miRNA。在牛脂肪細胞分化過程中，lncRNAADNCR作為ceRNA與miR-204結合，促進miR-204靶基因Sirt1表達，從而抑制脂肪細胞分化[15]。目前的研究主要關注牦牛繁殖性能[16]及乳腺發育[17]相關lncRNA，而對牦牛脂肪和肌肉發育相關lncRNA的報道較少。

研究發現，lncFAM200B在不同年齡秦川牛的肌肉和脂肪組織中差異表達，其第一內含子區域存在一個SNP位點，該多態位點與其體高、體斜長等生長性狀顯著相關[18]。然而，對于牦牛lncFAM200B序列特征的研究尚未見報道。本研究通過基因克隆和原核表達試驗分析并鑒定了牦牛lncFAM200B的序列特征和蛋白編碼能力；RT-qPCR檢測lncFAM200B在牦牛不同組織中的表達水平，最后通過TargetScan 7.1和miRanda軟件預測與lncFAM200B具有潛在相互作用miRNA的靶基因。為進一步解析該lncRNA在肌肉和脂肪發育過程中的功能及調控機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

選取0.5，4.5歲健康的類烏齊母牦牛各3頭，分別采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、臀肌和臀脂組織，用錫箔紙包裹并標記，迅速置于液氮中保存。

1.2 總RNA提取與cDNA合成

分別稱取0.05～0.10 g牦牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟、臀肌、臀脂組織于液氮中研磨，采用TRIzol法提取各組織總RNA，用NanoDrop 2000分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度和純度。按照TaKaRa反轉錄試劑盒(PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time))說明書進行cDNA合成。簡要步驟： ①去除基因組DNA，反應體系為5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，總RNA 800 ng，加RNase Free H2O至10 μL，42 ℃反應2 min； ②反轉錄反應，反應體系為第①步反應液10 μL，RNase Free H2O 4 μL，5×Prime Script Buffer 2(for Real time)4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，總體系20 μL。反應程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。所得cDNA置于-20 ℃保存備用。

1.3 lncFAM200B克隆

采用Primer Premier 5.0軟件，根據張思歡[18]研究所得lncFAM200B序列設計克隆引物，克隆引物在牦牛基因組中的位置如圖1所示。以克隆所得全長序列為模板設計實時熒光定量PCR引物，內參基因選擇GAPDH(NM_001034034.2)、UXT(NM_001037471.2)和RPS9(NM_001101152.2)，引物序列如表1所示。所有引物由北京擎科生物科技有限公司(成都分公司)合成。

橫線.牦牛基因組;橙色矩形.上游引物;藍色矩形.下游引物。 The horizontal line represents the yak genome; The orange rectangle indicates forward primer; The blue rectangle indicates reverse primer.

表1 引物序列Tab.1 Sequence of primers

以牦牛臀肌cDNA為模板進行PCR擴增，擴增體系：2×Dream Taq Green PCR Master Mix 12.5 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，加ddH2O至25 μL。反應程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，54.8 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，33個循環；72 ℃ 5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段，按照膠回收試劑盒說明書回收目的片段。將膠回收產物連接至pGEM-T載體，并轉化DH5α感受態細胞，經菌液PCR鑒定的陽性質粒送北京擎科生物科技有限公司測序。

1.4 lncFAM200B ORF及編碼能力預測

利用NCBI數據庫Open Reading Frame Finder工具分析lncFAM200B全長序列，預測其開放閱讀框。借助Coding Potential Calculator(CPC)網站(http://cpc.cbi.pku.edu.cn/)和Coding Potential Assessment Tool(CPAT)(http://lilab.research.bcm.edu/cpat/)在線預測工具預測其編碼潛能，以蛋白編碼基因GAPDH和已被驗證的長鏈非編碼RNAH19作為參照。

1.5 lncFAM200B原核表達

根據質粒提取試劑盒說明書提取質粒，使用Primer Premier 5.0分析lncFAM200B的酶切位點，選取pET-28a作為原核表達載體，將lncFAM200B全長序列亞克隆至pET-28a載體上。陽性對照選擇青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省、教育部重點實驗室保存的CSN3-28a原核表達質粒。

含BamHⅠ和HindⅢ 2個酶切位點的lncFAM200B片段與pET-28a質粒同時雙酶切，酶切體系：10×K Buffer 2 μL，BamHⅠ/HindⅢ各1 μL，pET-28a/lncFAM200B8 μL，加ddH2O至20 μL，37 ℃水浴3 h。酶切產物分別進行膠回收，采用T4DNA連接酶連接膠回收產物，連接產物轉入BL21(DE3)感受態細胞，獲得重組質粒lncFAM200B-28a表達菌種，提取質粒后進行雙酶切和測序鑒定。

經雙酶切和測序鑒定的陽性菌液，37 ℃搖床培養至OD值達到0.6～0.8時，以CSN3-28a為陽性對照，空載pET-28a為陰性對照，各加入終濃度為0.5，0.8，1.0 mmol/L IPTG溶液，誘導表達6 h。取1.5 mL誘導后的菌液沉淀，500 μL PBS緩沖液重懸沉淀，取12 μL菌液懸浮液與3 μL 5×SDS-PAGE Loading Buffer于沸水中煮沸10 min，菌體完全裂解后，取12 μL用于SDS-PAGE分析。凝膠經考馬斯亮藍R-250染色液染色，脫色液脫色，凝膠成像。

1.6 lncFAM200B組織表達譜

分別取0.5，4.5歲牦牛6個組織的cDNA，通過Real-time PCR反應檢測lncFAM200B在牦牛各組織中的表達水平，反應體系：TB Premix Ex TaqTMⅡ5 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板1 μL，RNase-Free ddH2O 3.2 μL，總體系10 μL。反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，39個循環后制作溶解曲線，每個樣品設置3個試驗重復。

1.7 lncFAM200B靶基因預測

利用miRDB(http://mirdb.org/index.html)數據庫篩選與lncFAM200B存在相互作用的miRNAs。結合生物學功能，選擇在線預測軟件TargetScan 7.1(http://www.targetscan.org/vert_71/)和miRanda(http://www.microrna.org/microrna/home.do)分別篩選與lncFAM200B存在相互作用miRNAs的靶基因，利用在線工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)取2個預測軟件靶基因預測結果交集，通過DAVID在線軟件(https://david.ncifcrf.gov/)對交集靶基因進行GO富集和KEGG信號通路分析；利用RBPDB(http://rbpdb.ccbr.utoronto.ca/)數據庫預測可能與lncFAM200B結合的靶蛋白。

1.8 數據分析

選擇GAPDH、UXT和RPS9幾何平均值校正內參基因表達量[19]，采用2-ΔΔCt法計算lncFAM200B在各組織中的相對表達量，用SPSS 18.0軟件中的One-Way ANOVA方法進行顯著性分析，并用LSD法進行檢驗。

2 結果與分析

2.1 lncFAM200B克隆

以牦牛臀肌cDNA為模板，PCR擴增后經電泳檢測獲得單一目的條帶(圖2)。測序結果表明，lncFAM200B全長大小為531 bp。

M.DNA Marker DL2000；1.lncFAM200B基因；2.陰性對照。 M.DNA Marker DL2000;1.lncFAM200B gene;2.Negative control.

2.2 lncFAM200B序列分析

采用DNAMAN軟件進行牦牛、普通牛lncFAM200B序列相似性分析，發現牦牛lncFAM200B序列與普通牛序列的83～142 bp(約59 bp)存在差異(圖3)，共存在6個堿基差異位點。

利用NCBI-Open Reading Frame Finder預測lncFAM200B開放閱讀框，得到35條預測結果，其中最長的開放閱讀框包含174個堿基，編碼57個氨基酸，小于一般編碼基因的氨基酸數(100 aa)，而該lncRNA長度大于200 nt，說明lncFAM200B可能是長鏈非編碼RNA。利用在線編碼能力預測工具CPC、CPAT對lncFAM200B、已知lncRNAH19和編碼基因GAPDH的編碼能力進行分析，如表2，3所示，lncFAM200B的注釋結果均為非編碼，進一步說明lncFAM200B可能為非編碼RNA(表2，3)。

Bos grunniens lncFAM200B.牦牛lncFAM200B；Bos taurus lncFAM200B.普通牛lncFAM200B。

表2 CPC網站編碼能力預測結果Tab.2 Coding capability prediction results of CPC

表3 CPAT網站編碼能力預測結果Tab.3 Coding capability prediction results of CPAT

2.3 lncFAM200B原核表達分析

為進一步驗證lncFAM200B是否具有編碼能力，本研究構建了lncFAM200B原核表達載體，根據質粒提取試劑盒說明書提取重組質粒lncFAM200B-28a，使用BamHⅠ、HindⅢ酶進行雙酶切鑒定。由圖4可知，除5 369 bp載體片段外，lncFAM200B-28a還檢測出一條531 bp大小的條帶，通過測序確認成功構建lncFAM200B原核表達載體。

經不同濃度的IPTG誘導表達后，SDS-PAGE分析結果顯示(圖5)，lncFAM200B-28a與陰性對照，即空載pET-28a表達情況一致，相同試驗條件下，陽性對照CSN3-28a成功表達25.32 ku左右的蛋白(CSN3表達21.58 ku蛋白，載體可表達3.74 ku蛋白)。綜合生物信息學分析結果及原核表達結果，確定lncFAM200B為長鏈非編碼RNA。

M.Marker Ⅲ；1.未酶切lncFAM200B-28a載體； 2.lncFAM200B-28a雙酶切結果。 M.Marker Ⅲ;1.Undigested lncFAM200B-28a vector; 2.lncFAM200B-28a double digestion results.

2.4 lncFAM200B組織表達結果分析

采用RT-qPCR技術分別檢測lncFAM200B在0.5，4.5歲牦牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟、臀肌和臀脂中的相對表達量。RT-qPCR結果(圖6)顯示，lncFAM200B在0.5歲牦牛各組織中均存在表達，在肺臟中的表達水平顯著高于其他組織(P<0.05)，但在4.5歲牦牛中，肺臟、肝臟表達量與臀肌、臀脂表達量差異顯著(P<0.05)；lncFAM200B在4.5歲牦牛心臟、肝臟、脾臟3個組織中的表達量顯著高于0.5歲，在肺臟中的表達量顯著低于0.5歲，臀肌和臀脂中的表達量在2個年齡之間差異不顯著(P>0.05)。

M.蛋白分子量標準；1-3.IPTG濃度0.5 mmol/L；4-6.IPTG濃度0.8 mmol/L；7-9.IPTG濃度1 mmol/L；1,4,7.空載體pET-28a；2,5,8.lncFAM200B-28a；3,6,9.CSN3-28a；藍色箭頭代表陽性對照CSN3-28a表達的25.32 ku蛋白位置。

字母相同表示差異不顯著(P>0.05)；小寫字母不同表示同年齡不同組織間差異顯著(P<0.05)；大寫字母表示lncFAM200B表達量在2個年齡之間差異顯著。

2.5 靶基因預測分析

利用miRDB數據庫篩選出24個可能與lncFAM200B存在相互作用的miRNAs，查閱文獻發現8個可能與肌肉及脂肪發育相關的miRNAs，分別是miR-411-5p[20]、miR-212-5p[21]、miR-138-5p[22]、miR-429[23]、miR-200b-3p[24]、miR-200c-3p[25]、miR-3613-3p[26]、miR-628-3p[27]。其中，miR-411-5p與lncFAM200B的結合位點位于101 bp處(圖7)，處于牦牛lncFAM200B相較于普通牛多出的59 bp內(圖3)。采用TargetScan 7.1和miRanda分別對上述8個miRNAs篩選出1 626，1 575個潛在靶基因，其中包括與脂肪代謝相關的沉默信息調節因子基因(Sirt1)、肌鈀蛋白基因(MYPN)、轉錄調節因子基因(KLF9)、硬脂酰輔酶5基因(SCD5)、磷酸酶基因及張力蛋白同源蛋白基因(PTEN)等。結合miRDB數據庫及2個預測軟件的分析結果，借助Cytoscape軟件構建lncFAM200B-miRNA-mRNA靶向關系的網絡調控圖(圖8)。

藍色字體序列為miR-411-5p與lncFAM200B結合位點。 The blue font sequence is miR-411-5p and lncFAM200B binding sites.

圖8 lncFAM200B與靶基因調控關系圖Fig.8 Relationship between lncFAM200B and target gene

利用TargetScan 7.1和miRanda 2個工具對與lncFAM200B相互作用的靶基因進行預測并取交集(圖9)，共獲得433個靶基因。對靶基因進行GO功能富集和KEGG信號通路富集分析。GO富集分析結果顯示，靶基因參與80個功能分類，注釋到生物學過程、細胞組分及分子功能3大類，其中生物學過程主要注釋到RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄負調控、細胞分化、細胞遷移的負調控、小GTP酶介導的信號轉導等，細胞組分主要涉及細胞質、核、核質、核染色質、粘著斑等，分子功能主要涉及染色質結合、核苷酸結合、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子活性、mRNA結合等(圖10)。KEGG通路分析結果顯示，靶基因共富集到9個通路上，其中富集程度最高的通路是癌癥中的microRNAs(圖11)。利用RBPDB數據庫預測出55個可能與lncFAM200B結合的靶蛋白(表4)，具有多個結合位點的靶蛋白包括EIF4B、RBMX、SFRS1、KHDRBS3、ELAVL1等蛋白，其中HNRNPA1[28]、FUS[29]、Pum2[30]、MBNL[31]4個靶蛋白可能與肌肉和脂肪發育相關。

圖9 miRanda與Targetscan靶基因預測結果韋恩圖Fig.9 The target gene Vienn diagram of miRanda and Targetscan

圖10 靶基因GO功能富集分析結果圖Fig.10 GO functional enrichment analysis of target gene

圖11 靶基因KEGG通路富集分析Fig.11 KEGG pathway enrichment analysis of target gene

3 討論與結論

隨著高通量測序技術的發展和對非編碼RNA研究的不斷深入，大量lncRNA被挖掘且功能和作用機制也逐漸被闡明。本研究獲得牦牛lncFAM200B全長531 bp，較張思歡[18]的秦川牛lncFAM200B全長多59 bp，經原核表達試驗驗證，牦牛lncFAM200B也不具備編碼蛋白的能力，在牦牛中也是一個真正的長鏈非編碼RNA。

3.1 lncFAM200B組織表達分析

本研究中，lncFAM200B在0.5，4.5歲牦牛的臀肌、臀脂中的表達量差異不顯著，與張思歡[18]發現lncFAM200B在成年牛肌肉中的表達水平顯著高于犢牛的研究結果不同。首先，牦牛lncFAM200B序列與普通牛lncFAM200B序列存在差異，可能導致與其結合的靶基因發生變化；其二，lncRNA作為非編碼RNA，在各物種間的保守性較差，表達豐度低[2]，可能導致其在各組織中的表達水平發生變化；其三，與牦牛肉脂肪含量低相關，研究表明，牦牛肉的脂肪含量小于秦川牛[32]，脂肪沉積是影響肉質風味的重要因素之一。而本研究中lncFAM200B在0.5歲牦牛肺臟中的表達量顯著高于其他組織，牦牛作為高原地區的特有牛種，在長期的自然選擇下，其肺臟已形成特定的結構特點來適應高壓低氧環境，如肺微動脈管壁和肺血-氣屏障均薄于低海拔地區的哺乳動物[33]，這種特點在低齡牦牛中表現更為明顯。因此，lncFAM200B在牦牛肺臟組織中高表達，可能與牦牛的高原低氧適應性相關。

表4 lncFAM200B靶蛋白預測結果Tab.4 lncFAM200B target protein prediction results

3.2 lncFAM200B-miRNA-mRNA網絡分析

本研究借助miRDB數據庫篩選出8個可能與lncFAM200B調控肌肉和脂肪發育相關的miRNA，包括miR-411-5p、miR-212-5p、miR-138-5p等。其中miR-411屬于miR-379家族，位于人類14號染色體[34]上DLK-DIO3區的miR-379/miR-656簇中。Harafuji等[35]研究發現，miR-411在面肩肱型肌營養不良癥(FSHD)成肌細胞中的表達與正常成肌細胞相比顯著上調，此外，過表達miR-411可抑制YAF2基因及肌源性標記基因MYOD、MYOG和MYH1的表達。miR-411-5p在橫紋肌肉瘤(RMS)中可作為分化誘導因子，miR-411-5p可通過直接下調SPRY4表達來促進p38MAPK活化[20]。而miR-411與lncFAM200B的結合位置位于比張思歡[18]研究中增加的59 bp內，推測存在差異的59 bp可能導致lncFAM200B在牦牛和普通牛中的功能存在差異。在經氧化的低密度脂蛋白處理的THP-1型巨噬細胞中，miR-212通過靶向Sirt1來抑制與脂質代謝和膽固醇逆轉運相關的ATP結合盒式運載蛋白A1(ABCA1)表達，從而促進脂質積累和減少膽固醇外流[21]。Guo等[36]的研究結果顯示，亮氨酸缺乏會顯著增加miR-212在肝中的表達水平，miR-212-5p通過與脂肪酸合酶(FAS)和乙酰輔酶A去飽和酶1(SCD1)的3′UTR結合來抑制酶活，此外，過表達miR-212可顯著降低甘油三酸酯(TG)積累。上述研究表明，miR-212在脂質代謝和積累過程中發揮重要作用。Liu等[37]通過雙熒光素酶報告分析發現，miR-138可直接與磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK1)的3′UTR結合，從而抑制PDK1表達，過表達miR-138可降低ASMCs的增殖，抑制miR-138表達則得到相反的結果。在另一研究中，miR-138可通過抑制Sirt1表達而促進db/db小鼠平滑肌細胞的增殖和遷移[22]。推測lncFAM200B可能通過直接與這些miRNAs結合或與miRNA競爭性結合靶基因，從而調控牦牛肌肉和脂肪的發育過程。

整合TargetScan 7.1和miRanda 2個靶基因預測工具預測結果，獲得433個靶基因，包括Sirt1、MYPN、KLF9、SCD5、PTEN等。Sirt1是依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的組蛋白脫乙酰酶，該基因可通過抑制PPARγ促進白色脂肪細胞中脂肪動員，并通過下調肌細胞標志基因表達來抑制成肌細胞分化[38]。MYPN作為肌肉的結構組分，其功能是保持肌節完整性以及調節Z線結構。研究發現，該基因的多態性會影響豬肉肉質、胴體性狀[39]。KLF9屬于基因轉錄調控因子，在脂肪發生中期，KLF9通過C/EBPα調控PPARγ2的表達，從而促進脂肪分化進程[40]。SCD5是硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)的異構體，是催化飽和脂肪酸去飽和化的關鍵酶，可影響肌內脂肪沉積[41]。研究發現，在牛脂肪細胞中，干擾PTEN基因表達可顯著抑制Caspase-3蛋白和提高p-Akt蛋白的表達，揭示PTEN基因可通過AKT信號通路抑制脂肪細胞凋亡[42]。

對篩選出的433個靶基因進行GO富集分析發現注釋到生物學過程的靶基因主要涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄調控過程、細胞分化過程、細胞增殖和遷移的調控過程等，也涉及白色脂肪細胞的分化過程，肌細胞的分化和增殖調控過程，這可能與lncFAM200B基因參與牦牛肌肉和脂肪發育調控有關。在細胞組成部分，除了富集程度較高的細胞質、核質、細胞骨架、核染色質等常規富集類別外，在對單個miRNA靶基因進行分析時，還包括肌動蛋白骨架、核膜等類別。在分子功能類別中，靶基因主要富集在RNA及DNA結合、酶的結合與活性中，lncFAM200B可能通過影響靶基因與其他分子的結合活性或酶活性來調控靶基因功能。KEGG信號通路分析顯示，與lncFAM200B相互作用的miRNAs的靶基因主要富集到癌癥中的miRNA、Focal adhesion信號通路，神經營養素信號通路、腫瘤的轉錄調控失調等。該結果提示，lncFAM200B可能通過Focal adhesion信號通路影響細胞的生長與分化，還可能影響癌癥形成過程中miRNAs的功能，從而參與癌癥的轉錄調控過程。

3.3 lncFAM200B靶蛋白分析

靶蛋白預測結果顯示，lncFAM200B靶蛋白參與RNA剪切和轉錄調控等過程，HNRNPA1、FUS、Pum2、MBNL1 4個靶蛋白被證明與肌肉和脂肪發育相關。HNRNPA1屬hnRNPs家族成員，敲除HNRNPA1基因的小鼠存在肌肉發育缺陷，出現了胚胎致死現象。RT-qPCR結果顯示，與野生型小鼠相比，該基因敲除小鼠中肌肉發育相關基因的表達存在顯著差異，如MEF2C、USP28、ABCC9等，推測該基因在胚胎肌肉發育過程中起重要調控作用[28]。FUS蛋白是hnRNP復合物的多功能蛋白組分之一，該基因在剪接過程發生突變可能導致肌萎縮側索硬化癥[29]。Pum2蛋白是胚胎發育和細胞分化過程中的翻譯抑制劑，被認為是脂肪干細胞中細胞增殖的正調節因子[30]。MBNL1蛋白是一種C3H型鋅指蛋白，該基因可調控肌肉相關基因Trim55和INSR的選擇性剪接，從而抑制肌肉細胞分化[31]。由此推測lncFAM200B可能通過與HNRNPA1、FUS、Pum2、MBNL1相互作用，從而影響肌肉和脂肪的發育。

本研究成功克隆了牦牛lncFAM200B的全長序列531 bp，相較于普通牛該lncRNA，其長度多59 bp，通過生物信息學分析和原核表達結果證明牦牛lncFAM200B為長鏈非編碼RNA。RT-qPCR結果顯示，lncFAM200B在肌肉和脂肪肺臟中的表達量較高。對lncFAM200B可能結合的miRNAs及靶蛋白進行預測分析，結果顯示牦牛lncFAM200B與普通牛差異的59 bp區段存在miR-411-5p的結合位點，相互作用miRNA的潛在靶基因(Sirt1、MYPN、KLF9、PTEN和SCD5)及靶蛋白(HNRNPA1、FUS、Pum2和MBNL1)與肌肉和脂肪發育相關。本研究為進一步探索lncFAM200B在牦牛肌肉和脂肪發育過程中的功能及分子機制奠定了基礎。