三種布魯氏菌血清抗體檢測(cè)方法在臨床應(yīng)用及評(píng)價(jià)

楊興坤段建華寇俊峰焦耿軍

（解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第940醫(yī)院安寧醫(yī)療區(qū)1，甘肅 蘭州，730070）

（甘肅省武威市涼州區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院2，甘肅 蘭州，733000）

布魯氏菌病病是一種由布魯氏菌引起的以動(dòng)物和人為傳染源的細(xì)菌性傳染疾病，其主要特點(diǎn)是人畜共患[1].布魯氏菌不僅感染感染途徑多樣而且臨床表現(xiàn)復(fù)雜多變，癥狀不同，輕重各異，給臨床診斷帶來(lái)一定的難度，容易誤診。因此實(shí)驗(yàn)室診斷尤為重要。為客觀評(píng)價(jià)三種布魯氏菌血清檢測(cè)方法的檢出效果，選擇本院936例血清標(biāo)本和自制50人份血清盤(pán)同時(shí)使用虎紅玻片凝集試驗(yàn)（RBPT）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）、人布魯氏菌抗體膠體金法（GICA）檢測(cè)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，對(duì)比其陽(yáng)性率，靈敏度，特異性，同時(shí)對(duì)檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集2019年1-7月期間我院門(mén)診就診患者936例血清標(biāo)本，同時(shí)用RBPT，SAT，GICA三種方法檢測(cè)，利用中國(guó)疾控中心布魯氏菌陰性、陽(yáng)性質(zhì)控血清自制50人份血清盤(pán)，分別是30人份陽(yáng)性血清標(biāo)本，20人份陰性血清標(biāo)本標(biāo)本。

1.2 器材與試劑 儀器：賽默飛-B2生物安全柜，可調(diào)式恒溫保溫箱，可調(diào)速多用振蕩器，微量移液器（量程：1-50ul，10-200uL，00-1000ul，Electron Finnpipette）計(jì)時(shí)器。耗材：一次性載玻片（2×4cm)，一次性玻璃試管（0.5×5cm)。試劑：布魯氏菌虎紅玻片凝集抗原、布魯氏菌試管凝集抗原由遼寧吉浩生物科技有限公司生產(chǎn)，人布魯氏菌IgG抗體檢測(cè)試劑盒（膠體金法）由中新生物科技有限公司生產(chǎn)，布魯氏菌陰性、陽(yáng)性質(zhì)控血清，500ml無(wú)菌生理鹽水。

1.3 方法 RBPT采用玻片凝集法：在室溫環(huán)境下，先取潔凈載玻片一張，然后吸取待檢標(biāo)本血清30 ul，再吸取虎紅凝集抗原30 ul充分混勻后，靜置五分鐘后觀察其凝集程度，具體參照參照 WS 269—2019《布魯氏菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果判定[2]。SAT采用試管凝集法：在室溫條件下，每份血清用 5支試管，第1管加入2.3ml生理鹽水，第2管不加，第3、4、5管各加入0.5ml。用移液器吸取待檢血清200ul，加入第1只試管中混勻。混勻后，以吸管吸取第1管中血清加入第2和第3管各 0.5 mL，以吸管將第三管混勻，并吸 0.5 mL加入第4管，混勻。從第4管吸取 0.5 mL加入第5管，混勻。再?gòu)牡?管吸取 0.5 mL棄去。如此稀釋后，從第2管到第5管血清稀釋度分別為 1：12.5、1：25、1：50 和 1：100。加入抗原。先以生理鹽水將抗原原液作適當(dāng)稀釋成抗原應(yīng)用液（按照說(shuō)明書(shū)操作，一般作 1：10稀釋?zhuān)♂尯蟮目乖瓚?yīng)用液加入各稀釋的血清管（第1管不加，作為血清對(duì)照），每管加 0.5 mL，混勻。加入抗原應(yīng)用液后第作者：INSTR-ADMIN二管至第五管，每管總量 1 mL，血清稀釋度從第二管到第五管分別為 1：25、1：50、1：100和 1：200。從第一管再吸出 0.5 mL棄去，剩 1 mL，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照。陰性血清對(duì)照，血清稀釋后加抗原應(yīng)用液（與待檢血清對(duì)照相似）；陽(yáng)性血清對(duì)照，其血清稀釋到原有滴度再加抗原應(yīng)用液；抗原對(duì)照，適當(dāng)稀釋的抗原加生理鹽水0.5 ml分別加入第 2至第 6管。則第 1管為抗體是否自凝對(duì)照，第 2至第 6管抗體稀釋倍數(shù)分別是 1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400。在振蕩器上混勻 5 min后，37℃孵育 20 h～ 22 h，再室溫放置 1 h～ 2 h，同時(shí)按相同方法作已知布病抗體陰、陽(yáng)性血清對(duì)照試驗(yàn)。結(jié)果判斷 方法：將試管與預(yù)先配制的“標(biāo)準(zhǔn)比濁管”對(duì)比，目測(cè)上部液體完全透明、管底呈明顯倒傘狀沉淀為 100%凝集：++++。上部液體近于完全透明、管底呈倒傘狀沉淀為 75%凝集：+++。上部液體略微透明、管底呈較薄傘狀沉淀為 50%凝集：++。上部液體稍微透明、管底呈不很明顯傘狀沉淀為 25%凝集：+。上部液體混濁不透明、管底無(wú)傘狀沉淀，而是圓點(diǎn)或圓 盤(pán)狀沉淀，為不凝集：－。對(duì)“－”性結(jié)果需再孵育 24 h，按上述標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。膠體金法：實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書(shū)操作。結(jié)果判定：陽(yáng)性為質(zhì)控線（C)和檢測(cè)線(T)同時(shí)出現(xiàn)兩條紅色條帶。陰性為只在質(zhì)控線（C)位置出現(xiàn)一條紅色帶。無(wú)效為質(zhì)控線（C)和檢測(cè)線(T)均未出現(xiàn)紅色條帶。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS16.0軟件加以處理，數(shù)據(jù)用（%）表示，行X2檢驗(yàn)，若P值＜0.05則表明差異明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RBPT、SAT、GICA檢測(cè)結(jié)果分析 對(duì)936人份血清標(biāo)本分別用三種方法平行檢測(cè)結(jié)果詳見(jiàn)下表1。

表1 RBPT、SAT、GICA檢測(cè)結(jié)果分析

2.2 RBPT、SAT兩種方法價(jià)檢測(cè)結(jié)果分析 對(duì) 936人份血清分別用RBRT與SAT兩種方法價(jià)檢測(cè)結(jié)果對(duì)比見(jiàn)表2。

表2 RBPT、SAT兩種方法價(jià)檢測(cè)結(jié)果分析

2.3 RBRT與GICA兩種方法檢測(cè)結(jié)果分析 對(duì) 936人份血清分別用RBRT與GICA兩種方法價(jià)檢測(cè)結(jié)果對(duì)比見(jiàn)表3。

表3 RBRT與GICA兩種方法檢測(cè)結(jié)果分析

2.4 RBRT與GICA兩種方法檢測(cè)結(jié)果分析 對(duì) 936人份血清SAT與GICA兩種方法價(jià)檢測(cè)結(jié)果對(duì)比見(jiàn)表4。

表4 RBRT與GICA兩種方法檢測(cè)結(jié)果分析

2.5 三種檢測(cè)試劑盒的性能結(jié)果 三種布魯氏菌抗體檢測(cè)試劑盒的性能見(jiàn)表5。

表5 三種檢測(cè)試劑盒的性能結(jié)果

3 討論

布魯氏菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法有：細(xì)菌分離培養(yǎng)、虎紅玻片凝集試驗(yàn)（RBPT）、試管凝集試驗(yàn)（SAT)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、膠體金標(biāo)試驗(yàn)（GICA），抗人免疫球蛋白試驗(yàn)（Coomb`s）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等，細(xì)菌分離培養(yǎng)技術(shù)是最傳統(tǒng)的布魯氏菌病細(xì)菌學(xué)診斷方法，也是診斷布魯氏菌病的“金標(biāo)準(zhǔn)”[3]，但是臨床上細(xì)菌培養(yǎng)的陽(yáng)性率不高，因此臨床上診斷布魯氏菌病常用的方法主要有PBRT、SAT、CFT、ELSIA、GICA.RBPT是臨床初步篩查布病的常用檢測(cè)方法之一，因其在臨床檢驗(yàn)中檢測(cè)成本低，敏感性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單[4]，反應(yīng)快，耗時(shí)短，適合應(yīng)用于布魯氏菌病的大規(guī)模初篩檢驗(yàn)，但缺點(diǎn)是PBRT以布氏桿菌細(xì)胞壁的脂多糖上的O-鏈抗原作為診斷靶點(diǎn)[5]，且布氏桿菌與小腸耶爾森O9、大腸桿菌O157、沙門(mén)氏菌具有高度的類(lèi)似O抗原，易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性；另一個(gè)缺點(diǎn)為RBPT易受到外界因素的影響（溫度、凝集時(shí)間、光線等)，或者受采血及檢測(cè)人員水平的限制造成假陰性結(jié)果[6]。SAT是屬國(guó)內(nèi)法定診斷布病的確診方法，優(yōu)點(diǎn)為特異性、準(zhǔn)確性高于PBPT；但缺點(diǎn)為與PBRT、GICA相比而言操作相對(duì)復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，通常須在恒溫箱放置20-22小時(shí)后，置室溫1-2小時(shí)觀察結(jié)果，且由于血清中存在不完全抗體競(jìng)爭(zhēng)抗原而造成抗原抗體比例失調(diào)而造成前帶現(xiàn)象[7]，造成結(jié)果假陰性。GICA采用膠體金免疫層析技術(shù)原理，在硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線包被重組布魯氏菌抗原，在質(zhì)控線包被山羊抗小鼠IgG多克隆抗體，在金標(biāo)墊上包被膠體金標(biāo)記的小鼠抗人IgG多克隆抗體。當(dāng)檢測(cè)陽(yáng)性樣本時(shí)，陽(yáng)性血清中的布魯氏菌IgG抗體可與膠體金標(biāo)記的人鼠抗人IgG抗體結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，由于層析作用復(fù)合物與樣本在硝酸纖維素膜內(nèi)向前流動(dòng)。當(dāng)復(fù)合物經(jīng)過(guò)檢測(cè)時(shí)與寶貝的重組布魯氏菌抗原結(jié)合，形成“Au-小鼠抗人IgG單克隆抗體-布魯氏菌IgG抗體-布魯氏菌抗原而凝集顯色。其優(yōu)點(diǎn)為操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)少，結(jié)果易判定，且靈敏度高，缺點(diǎn)為特異性差，易受到血樣、溫度、濕度的影響易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

三種布魯氏菌血清抗體檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)分析：RBPT、SAT、GICA 三種檢測(cè)方法的陽(yáng)性率分別為27.62%，19.19%，28.34%，RBPT法與GICA法相比，兩種方法陽(yáng)性率高，靈敏度高，適合布病初篩。RBPT法與SAT法比較（P值＜0.05），SAT法特異性高GICA法與SAT法相比較（P值＜0.05），GICA法靈敏性高。

綜上所述，RBPT、GICA適用于大樣本量的檢驗(yàn)，以及布魯氏菌病的初篩，SAT適用于小樣本量的檢驗(yàn)，用于布魯氏菌病的確診.三種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，在臨床實(shí)驗(yàn)室診斷中應(yīng)該采用RBPT、SAT或GICA、SAT聯(lián)合檢測(cè)。