小鼠側腦室下區基因表達的增齡性變化研究

黃藝瀅,石桂英,呂 穎,李珂雅,白 琳

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所,北京協和醫學院比較醫學中心,國家衛生健康委員會人類疾病比較醫學重點實驗室,國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室,北京 100021)

嚙齒動物中樞神經系統(central nervous system,CNS)中神經元的產生是一個持久的過程,不僅發生在胚胎階段,而且發生在整個成年期的大腦的部分區域[1-2]。 成體神經發生是指神經干細胞(neural stem cells, NSCs)增殖并產生新神經元,經過遷移、分化形成成熟的神經元,最終整合到原有的神經回路中的過程。 成體NSCs 主要存在于兩個區域:海馬齒狀回的顆粒下區(subgranular zone,SGZ)和側腦室下區(subventricular zone,SVZ)[3-4]。 NSCs 提供新的神經元,有助于大腦的可塑性、學習、記憶和修復。 隨著年齡的增長,在中年期NSC 功能就會下降,導致增殖細胞減少,神經元輸出減少。

SVZ 的NSCs 是星形膠質細胞樣靜息細胞,表達神經膠質原纖維酸性蛋白和CD133,被稱為B 型細胞。 B 型細胞被激活,泛干細胞標記物巢蛋白和表皮生長因子受體表達上調,并進行分裂[5-6],產生轉運擴增型的C 型細胞。 C 型細胞最終產生成神經細胞,其形成鏈并從SVZ 遷移到吻側遷移流中,最終到達嗅球。 一部分神經母細胞整合入已有的神經回路,成熟成為多巴胺能或GABA 能神經元[7-8]。由此可見, SVZ 對于成年期大腦的神經元產生十分重要。

研究表明小鼠SVZ 在衰老過程中變得更薄,表現出增殖和神經發生的顯著減少[9]。 并且在老年小鼠中,SVZ 中的B 型NSCs 更多處于增殖狀態,但其總體數量減少[10],這可能是由于早在成年期,活化的B 型NSCs 細胞周期延長,防止衰老的神經干細胞池(NSC pool)的消耗[11-12]。 另外在衰老過程中,SVZ 內小膠質細胞變化顯著。 小膠質細胞是大腦中主要的免疫細胞,有助于大腦的神經發育和神經細胞功能的維持[13]。 在中年時,SVZ 中的小膠質細胞開始表現出活化的吞噬細胞狀態,并釋放促炎細胞因子,導致小膠質細胞介導的炎癥反應穩步增加,最終在老年時期導致腦中產生抗神經生成的微環境[14]。

目前已有大量SVZ 細胞增齡性改變的研究[15-17],但相關的分子機制仍未完全闡明。 因此我們采用轉錄組測序技術研究幼年期、成年期和老年期小鼠SVZ 基因表達的差異,以此研究其增齡性改變的分子機制。 本研究選取3 周齡, 6 月齡和20 月齡小鼠,采用Illumina 測序平臺對小鼠SVZ 的差異基因表達進行分析,并通過實時熒光定量PCR(realtime quantitative PCR,qPCR)檢測差異表達基因的表達情況以驗證轉錄組測序技術(RNA sequencing,RNA-Seq)結果的可信度。 通過GO 和KEGG 分析其差異基因和參與的信號通路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級C57BL 小鼠購買于北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0009],并在本所三層屏障環境動物房[SYXK(京)2015-0035]中長期進行飼養繁殖,選取幼年期(3 周齡,體重9 ～11 g),成年期(6 月齡,體重25 ～35 g)和老年期(20 月齡,體重28～35 g)小鼠各6 只,雌雄各半,取腦組織的SVZ 進行研究。 經本所實驗動物管理和使用委員會(IACUC)審批,IACUC 號為BL17001。 實驗動物飼養繁育和實驗過程中,嚴格按照實驗動物使用的3R 原則給予人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

TRIzol Reagent (Thermo, 美 國); NEBNext ?UltraTMRNA 文庫制備試劑盒(NEB, 美國);PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)、 TB Green Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus) (TaKaRa,日本);Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent,美國);StepOnePlusTM(Thermo,美國);實時熒光定量PCR(qPCR)所使用的正向和反向引物見表1。

1.3 實驗方法

1.3.1 總RNA 提取

提取每只小鼠的SVZ,使用TRIzol Reagent 試劑盒按照操作流程提取總RNA,測定濃度后按照幼年期,成年期和老年期3 個組分別將6 個樣本等量混合構建cDNA 文庫。

1.3.2 文庫構建與質檢

簡而言之,使用NEBNext? UltraTMRNA 文庫制備試劑盒(NEB,美國)進行建庫。 使用poly-T oligo連接的磁珠純化mRNA,然后通過離子打斷將mRNA 隨機打斷。 在M-MuLV 逆轉錄酶體系中,以片段化的mRNA 為模板合成cDNA 第1 條鏈,然后通過RNA 酶H 和DNA 聚合酶I 合成第2 條鏈。 將cDNA 用AMPure XP beads 篩選為200 bp 左右的cDNA,通過PCR 擴增并純化后得到文庫。 最后,使 用Agilent Bioanalyzer 2100 評估文庫質量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.3 上機測序

庫檢合格后,選擇北京諾禾致源科技股份有限公司,按照有效濃度把不同文庫進行Illumina 測序,并產生150 bp 配對末端讀數。

1.3.4 數據處理

對原始數據進行過濾,去除帶有接頭或低質量的序列數據,對過濾后的干凈數據進行Q20,Q30 和GC 含量計算。 使用Hisat2 v2.0.5 將配對末端干凈數據與參考基因組比對。

1.3.5 差異基因分析

將序列數據映射到每個基因數值用HTSeq 計算。 每個基因的FPKM 通過基因的長度進行計算,并將序列數據映射到該基因的數值進行統計。 然后使用DEGSeq R 軟件進行差異表達分析。 最后使用Benjamini-Hochberg 校正P 值。 校正后的P 值≤0.05 和|log2foldchange|≥1 為顯著差異表達。

1.3.6 功能富集分析

通過ClusterProfiler R 軟件進行包括GO 與KEGG 通路的富集在內的差異表達基因的功能富集分析。 校正后的P 值≤0.05 的GO term 通過差異表達基因顯著富集。

1.3.7 qPCR

使用反轉錄試劑盒(TaKaRa,日本)將提取的mRNA 反轉錄為cDNA。 通過qPCR 檢測差異表達基因的表達情況以驗證RNA-Seq 結果的可信度。TaKaRa 該20 μL 反應體系含20 ng cDNA,正向和反向引物(表1)各400 nmol/L,0.4 μL ROX(50×)和10 μL SYBR Premix Ex Taq II(2×)(TaKaRa)。 反應包括95℃30 s,隨后95℃5 s,60℃30 s,進行40 次循環。 在StepOnePlusTM實時熒光定量PCR 系統-Life Tech(Applied Biosystems)進行檢測。 每個基因設置三個復孔,將每個基因的CT 值用內參基因βactin 的CT 值進行標準化。 計算公式為:相對表達量=2-ΔΔCT,ΔΔCt=ΔCt(實驗組) - ΔCt(對照組),ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(內參基因)。

1.4 統計學方法

qPCR 實驗設置3 個復孔,使用SPSS 軟件通過Shapiro-Wilk 檢驗和F 檢驗來檢驗基因相對表達量的正態分布和方差齊性,使用GraphPad Prism 5.0軟件分析數據,數據表示為平均數±標準誤差( ˉx ±sˉx)。 對于符合正態分布和方差齊性的數據,使用單因素方差分析(one-way ANOVA followed by Dunnett’s test),對于不符合正太分布的數據使用Mann-Whitney U 秩和檢驗。 在整個研究中,P＜0.05被認為有顯著差異。

2 結果

圖1 差異表達基因火山圖Figure 1 Volcano chart of differentially expressed genes

2.1 差異表達基因的篩選

根據數據質量檢測結果可知,本次測序的有效性好,數據豐富。

差異表達基因火山圖(圖1)可直觀反應總體基因的分布情況,結果表明幼年期、成年期及老年期小鼠SVZ 的NSC 轉錄組表達水平差異較大。 差異基因Venn 圖(圖2)用于顯示差異基因的重疊區域,表示各組差異基因之間的關系。 幼年期、成年期及老年期小鼠共同擁有的差異基因有12 個,分別是Rgs9、Cd4、Gpr6、Ido1、Gpr88、Adora2a、Sh3rf2、Drd1、Serpina9、Actn2、Penk、Sytl5。

如圖3 所示,與幼年小鼠相比,成年小鼠中86個基因表達上調,167 個下調。 老年小鼠中213 個基因表達上調,306 個下調。 與成年小鼠相比,老年小鼠中71 個基因表達上調,76 個下調。 與幼年小鼠相比,成年小鼠上調或下調編碼蛋白基因前10 位如表2 所示,老年小鼠上調或下調編碼蛋白基因前10 位如表3 所示,與成年小鼠相比,老年小鼠上調或下調編碼蛋白基因前10 位如表4 所示。

另外為了驗證轉錄組測序結果的可信度,通過實時熒光定量PCR(qPCR)檢測差異表達基因的表達情況。 如圖4 所示,qPCR 檢測的幾個基因表達情況與轉錄組測序結果一致。

表2 下調或上調編碼蛋白基因前10 位(幼年小鼠與成年小鼠相比)Table 2 The top 10 protein-coding genes (young mice compared with adult mice)

圖2 差異基因表達Venn 圖Figure 2 Venn chart of differentially expressed genes

圖3 幼年、成年與老年期小鼠神經干細胞差異表達基因統計Figure 3 Statistics of differentially expressed genes in young,adult, and old mice

表3 下調或上調編碼蛋白基因前10 位(幼年小鼠與老年小鼠相比)Table 3 The top 10 protein-coding genes (young mice compared with old mice)

表4 下調或上調編碼蛋白基因前10 位(成年小鼠與老年小鼠相比)Table 4 The top 10 protein-coding genes (adult mice compared with old mice)

2.2 GO 分析

利用clusterProfiler R 軟件對差異基因進行GO分析(圖5),結果可分為生物過程(biological process, BP)、細胞組分(cellular component, CC)、和分子功能(molecular function, MF)3 個大類。 對各類中涉及差異表達基因差異較顯著的前5 位生物學功能進行分析,成年期小鼠SVZ 與幼年期相比,在生物過程中差異表達基因主要涉及對維生素及鹽脅迫的反應、調節體液水平和調節腺苷酸環化酶活性等;在細胞組分中,差異表達基因主要涉及細胞外基質;在分子功能中,差異表達基因主要涉及生長因子結合、蛋白酶結合、激素活動與藥物結合。老年期小鼠SVZ 與幼年期相比,在生物過程中差異表達基因主要涉及單一生物行為、中樞神經系統神經元分化與生成、循環系統過程等;在細胞組分中,差異表達基因主要涉及神經元投射;在分子功能中,差異表達基因主要涉及G 蛋白偶聯受體活性、胺結合、血清素結合等。 老年期小鼠SVZ 與成年期相比,在生物過程中差異表達基因主要涉及單一生物行為、神經元分化與生成、運動行為等;在細胞組分中,差異表達基因主要涉及神經元投射;在分子功能中,差異表達基因主要涉及神經肽激素活性、激素活動、神經遞質受體活性等。

2.3 KEGG 分析

利用clusterProfiler R 軟件對差異基因進行KEGG 通路分析(圖6)。 成年期與幼年期小鼠的SVZ比較,差異表達基因涉及蛋白質消化吸收的信號通路。 老年期與幼年期小鼠的SVZ 比較,涉及信號通路較多,包括神經活性配體-受體相互作用、cAMP 信號通路、嗎啡成癮、多巴胺能突觸、膽堿能突觸、GABA能突觸等。 老年期與成年期小鼠的SVZ 比較,涉及神經活性配體-受體相互作用和GABA 能突觸。

圖4 差異基因表達qPCR 驗證Figure 4 qPCR verification of differentially expressed genes

3 討論

3.1 RNA-Seq 可靠性分析

RNA-Seq 是較為成熟的一種使用深度測序技術的轉錄組分析方法。 與其他方法相比,RNA-Seq可以更精確快速的獲取待測樣品大量的轉錄本信息,為研究基因表達提供了更加方便快捷的途徑[18]。 本研究通過Illumina 測序平臺分析檢測小鼠幼年期、成年期和老年期SVZ 的cDNA 文庫,獲得小鼠SVZ 在不同時期基因表達的增齡化改變。結果表明(表5),選擇的實驗材料測序質量好,Q20比例均在97%以上,Q30 比例均在93%以上;在小鼠幼年、成年和老年期SVZ 分別檢測到55983268、73094774 和53309824 個有效的reads,對比效率為95.37%、95.62%和95.04%,顯示比對效率較好,測序質量高(表6)。

3.2 基因差異表達分析

SVZ 及位于其中的NSCs 對于成年期大腦的神經元產生十分重要,有助于大腦的可塑性,記憶,學習及修復。 研究表明,位于SVZ 的NSCs 出現增齡性改變,老年小鼠(28 月齡)的SVZ 與年輕小鼠(2月齡)相比,厚度明顯變薄,老年小鼠NSCs 的增殖水平下降,衰老與活性氧水平升高[15]。

本研究對小鼠幼年、成年和老年期SVZ 的cDNA 文庫進行分析,幼年與成年期或老年期小鼠對比,共檢測到253 個及519 個差異表達的基因;成年與老年期小鼠對比,共檢測到147 個差異表達的基因。 意料之中的是,由于小鼠從幼年到老年發育時間跨度較長,差異表達的基因數目最多。 小鼠作為經典的模式生物,參考基因在比對數據庫中較為全面,本研究選用小鼠作為研究對象,差異表達基因被注釋的比例在GO 與KEGG 功能分類中比其他物種更高。 老年與幼年期小鼠對比,差異表達基因數量和KEGG 通路中差異表達基因的富集較成年與幼年期小鼠對比、老年與成年期小鼠對比更多,可能是由于時間跨度較其他兩種更大。

圖5 GO 功能分類Figure 5 GO function classification

表5 NSCs 轉錄組測序數據評價分析Table 5 Evaluation of transcriptome sequencing data of NSCs

表6 NSCs 轉錄組測序數據比對結果基本統計Table 6 Basic statistics of transcriptome sequencing data of NSCs

3.3 差異表達基因的功能分析

在GO 分析中發現,在生物過程與細胞組分中,幼年期與成年期小鼠SVZ 的差異基因多涉及離子代謝和細胞外基質,而老年期小鼠SVZ 與幼年期和成年期相比,主要涉及神經生成分化與神經投射等。 這可能說明了幼年與成年小鼠SVZ 在神經生成分化水平上并無明顯差別,而老年期小鼠SVZ 中NSC 增殖水平下降,發生增齡性改變。 根據測序結果在成年期比幼年期與神經分化或遷移相關的蛋白,如Drd1 和Drd2 等,發生了少量降低,而在老年期,這些基因的表達發生了劇烈下降。 在分子功能中,這三個年齡段的小鼠均涉及到了激素與神經遞質的變化。 以G 蛋白偶聯受體活性相關基因為例,其中部分基因(如Gpr88 與Adora2a 等)隨年齡增加表達逐漸下降,而部分基因(如Oprd1、Htr1a 等)只在老年階段發生下降,這些只在老年階段表達發生改變的基因,可能與衰老過程密切相關。

由測序及qPCR 結果發現,部分基因的表達未隨年齡增長而升高或下降,而是只在成年階段升高或降低。 如神經元分化因子(neuronal differentiation 6,Neurod6),僅在成年時期表達升高。 Neurod6 是一種腦特異性堿性螺旋-環-螺旋(basic helix-loophelix,bHLH)轉錄因子,是正在發育的CNS 中神經前體細胞的分化因子[19],研究表明,Neurod6 在大腦皮層,海馬和小腦的成熟成體神經元中大量表達[20],位于SVZ 表達Neurod6 的祖細胞具有在上皮質層(upper cortical layers)中分化成錐體谷氨酸能神經元的能力[21],并且Neurod6 可以調節神經投射的正確形成[19]。 另外,Neurod6 作為ROS 穩態調節劑的新作用,導致對氧化應激的耐受性增強。 有研究表明,通過轉錄組測序發現,在阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s Disease, AD)患者腦中不同部位,Neurod6 的表達一致下調[22]。 本研究在幼年期、成年期和老年期均檢測到Neurod6 的表達,且老年小鼠SVZ 中Neurod6 表達水平低于成年小鼠,這可能是由于神經凋亡,對氧化應激的耐受性降低,且可能有AD 病變傾向,但尚未有研究表明幼年期小鼠SVZ 中Neurod6 表達水平低于成年小鼠。 基質金屬蛋白酶3(matrix metalloproteinase-3,MMP3)與趨化因子CCL21b(chemokine (C-C motif) ligand 21B(leucine),CCL21b)在GO 分類細胞組分中都屬于細胞外基質相關基因,且兩者都在成年期劇烈降低,CCL21b 是體外淋巴細胞和樹突狀細胞的有效化學引誘物[23],但目前與神經相關的研究極少。MMP3 在細胞外基質的降解過程中發揮了重要作用[24],目前,對于CCL21b 和MMP3 的研究多幾種在炎癥與腫瘤相關疾病。 有研究表明,MMP3 的表達升高會破壞神經元之間的緊密連接,并且消除神經相關蛋白如DJ-1 對氧化損傷的保護作用,從而導致了神經退行性疾病。

圖6 差異表達基因KEGG 通路分析Figure 6 KEGG pathway analysis of differentially expressed genes

3.4 結論

本研究對幼年期、中年期和老年期小鼠SVZ 進行RNA-seq,檢測小鼠SVZ 基因表達差異和相關信號通路的增齡性改變。 該研究為豐富小鼠不同年齡段SVZ 轉錄組信息提供了數據,為探討SVZ 的功能發育和退化,進一步治療和抵抗神經衰老提供新的理論依據和方法。