連樸飲防治慢性萎縮性胃炎的作用機理研究

向 陽，戚 璐，呂文亮*

1湖北中醫藥大學，武漢 630065；2生物資源保護與利用湖北省重點實驗室；3湖北民族大學醫學部，恩施 445000

連樸飲首見于清代醫家王孟英所著《霍亂論》，又名王氏連樸飲。初為治療濕熱霍亂而設，《霍亂論·卷下》載：“治濕熱蘊伏而成濕熱霍亂，兼能行食滌痰”[1]，方由黃連、厚樸、半夏、石菖蒲、淡豆豉、蘆根、梔子七味中藥組成，具有清熱化濕，理氣和中之功效，其證多見濕熱蘊伏、霍亂吐利、胸脘痞滿、口渴心煩，小便短赤，苔黃膩等。王氏曾言：“諸郁之發，必從熱化。土郁者，中焦濕盛，而升降之機乃窒”[2]，故后世醫家多基于此，利用連樸飲開郁化濁、升降氣機之功，化裁治療濕熱并重、困阻中焦的內科雜病。

慢性萎縮性胃炎是由多種原因引起的胃組織黏膜的慢性炎性反應，屬于消化系統常見病之一[3]。依據臨床癥狀表現可歸于中醫 “胃脘痛”、“痞滿”、“反酸”、“嘈雜”等范疇。現代研究認為H.pylori感染是慢性萎縮性胃炎發生的最主要病因，此外膽汁反流、長期服用NSAIDs等藥物和乙醇攝入是慢性胃炎相對常見的病因[4]。由于該病機理復雜，病情容易反復發作，抗炎和根除幽門螺桿菌的治療方式又具有很大的局限性，由慢性非可控性炎癥向癌癥惡性轉化的“炎-癌轉化”模式，越來越受到人們的廣泛關注。2017年中國中西醫結合學會消化系統疾病專業委員會將連樸飲列為防治慢性萎縮性、非萎縮性胃炎脾胃濕熱證的推薦方劑[3,4]，雖然連樸飲的臨床療效得到肯定，但其作用機理尚不明晰，本研究旨在運用現代網絡藥理學方法對連樸飲防治慢性萎縮性胃炎“炎癌轉化”作用機理進行探討，并利用分子對接技術進行初步驗證，為今后的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 連樸飲中藥成分與靶標篩選

利用TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)數據庫檢索連樸飲方中7味中藥(黃連、厚樸、半夏、梔子、石菖蒲、蘆根、淡豆豉)的活性成分，并進行靶標預測，設定口服生物了利用度(OB)≥30%且類藥性(DL)≥0.18為篩選條件建立中藥成分數據庫；下載中藥活性成分的MOL2格式文件，經AutoDock1.5.6軟件處理、轉換為pdbqt文件保存用于分子對接實驗；同時，檢索獲取所有成分的作用靶標，上傳至Uniprot數據庫進行靶標-基因名稱轉換保存備用。在GeneCards(https://www.genecards.org/)和OMIM Gene Map(https://www.omim.org/search/advanced/geneMap)數據庫中以“chronic atrophic gastritis”為關鍵詞獲取慢性萎縮性胃炎的相關基因，合并數據集并去重后與轉換后的中藥靶標取交集，作為共有靶標，并利用Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線工具繪制韋恩圖。

1.2 蛋白互作網絡構建

將共有靶標導入STRING11.0(https://string-db.org/)平臺進行蛋白互作分析，設定物種為Homo sapiens，置信度大于0.9進行篩選，隱藏離散節點，制作PPI網絡圖；下載tsv文件，導入Cytoscape 3.6.2軟件，結合MCODE插件進行靶標聚類，篩選與免疫、炎癥相關的核心聚類靶標用于分子對接；同時構建中藥-成分-靶標-疾病網絡，并對網絡圖拓撲值進行計算，按度值、介度中位數值的2倍卡值篩選獲得中藥化合物核心節點。

1.3 基因本體、通路分析及分子對接驗證

將共有靶標輸入DAVID6.8在線平臺(https://david.ncifcrf.gov/conversion.jsp)獲取靶點蛋白ID，借助R(clusterProfiler包)進行基因本體、KEGG信號通路分析，據P≦0.05進行分析，取P-value值最小前20條目制圖，并根據富集結果抽取與免疫、炎癥相關的信號通路分析其作用機理。在PDB(https://www.rcsb.org/)數據庫以Homo sapiens來源檢索獲取核心靶標的晶體結構，借助AutoDockTool、Vina軟件與化合物進行分子對接，搜集分析結合能(kcal/mol)值，佐證連樸飲防治慢性萎縮性胃炎的合理性。

2 結果

2.1 連樸飲中藥活性成分及靶標篩選結果

從TCMSP數據庫中檢索發現黃連活性成分58個、厚樸139個、半夏116個、石菖蒲105個、梔子98個、淡豆豉15個、蘆根31個，按照OB≧30%且DL≧0.18條件篩選最終獲得中藥活性成分共45種(見表1)，獲取作用靶標193個；從GeneCards、OMIM數據庫獲得疾病靶標686個；將所有中藥靶標通過Uniprot數據庫轉換后與疾病靶標取交集，獲得共有靶標81個(見圖1)。

續表1(Continued Tab.1)

圖1 藥物與疾病共同靶標韋恩圖Fig.1 Venn diagram of common targets for drugs and disease

2.2 網絡構建及蛋白互作結果

通過STRING11.0平臺分析獲得靶標蛋白互作網絡圖(圖2)，其中節點164個、邊269條、平均節點度：6.64、平均局部聚類系數：0.442；利用Cytoscape 3.6.2軟件的MCODE插件對該網絡圖進行聚類分析得到4個子網絡，據得分最高創建核心靶標網絡圖(圖3)，核心靶標網絡(得分6.909)中的節點有：原癌基因c(proto-oncogene c-Fos，FOS)、細胞間粘附分子(intercellular adhesion molecule 1，ICAM1)、白細胞介素1β(interleukin-1 beta，IL1B)、白介素6(interleukin-6，IL6)、白介素10(interleukin-10，IL10)、C-C基序趨化因子2(c-c motif chemokine 2，CCL2)、C-X-C基序趨化因子2(c-x-c motif chemokine 2，CXCL2)、轉錄因子p65(transcription factor p65，RELA)、絲裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)、干擾素γ(interferon gamma，IFNG)、白介素8(interleukin-8，CXCL8)，該核心聚類與免疫炎癥關系最為密切，故作為后續分子對接的核心靶標。以共有靶標構建中藥-成分-靶標-疾病網絡圖(圖4)，圖中三角形節點代表慢性萎縮性胃炎，橢圓形節點代表作用靶標，菱形節點代表活性成分，箭頭節點代表藥物。經NetworkAnalyzer工具計算該網絡度值中位數為4，介度中位數為0.000 389 87，按度值、介度中位數值的2倍卡值篩選獲得中藥化合物核心節點(表2)，提示這些化合物是連樸飲的主要活性成分。

表2 主要活性成分信息Table 2 Main active ingredient information

圖2 蛋白互作網絡圖Fig.2 Network diagram of protein-protein interaction

圖3 核心靶標網絡圖Fig.3 Core target network diagram

圖4 中藥-成分-靶標-疾病網絡Fig.4 Traditional chinese medicine-ingredient-target-disease network

2.3 靶標基因本體、信號通路富集結果

通過基因本體(GO)富集分析發現連樸飲防治慢性萎縮性胃炎的生物學作用可能主要涉及細胞因子受體結合、細胞因子活性、泛素樣蛋白連接酶結合、受體配體活性、激酶調節活性等，取P-value值前20條目制圖如圖5所示，圖中泡泡節點的顏色由藍到紅漸變代表P-value值越小，節點由小到大漸變代表富集靶標數量越多。通過KEGG信號通路富集分析，P-value最小前20條目如圖6所示，圖中泡泡節點的顏色由藍到紅漸變代表P值越小，節點由小到大漸變代表富集靶標數量越多。抽取結果中與免疫、信號傳導相關的信號通路有：IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)、C型凝集素受體信號通路(C-type lectin receptor signaling pathway)、Th17細胞分化(Th17 cell differentiation)信號通路，這些信號通路與靶標相互關系如圖7所示，提示這些信號通路和靶標與慢性萎縮性胃炎“炎癌轉化”作用密切相關。

圖5 GO富集結果信息(top 20)Fig.5 GO enrichment result information(top 20)

圖6 KEGG信號通路富集結果信息(top 20)Fig.6 KEGG signal pathway enrichment result information(top 20)

圖7 與免疫炎癥相關的主要信號通路與靶標的映射信息Fig.7 Mapping information of major signaling pathways and targets related to immune inflammation

2.4 分子對接結果

核心靶標FOS、ICAM1、IL1B、IL6、IL10、CCL2、CXCL2、RELA、MAPK8、MAPK1、IFNG、CXCL8在PDB數據庫檢索獲取得到的晶體結構ID依次為：1A02、1IAM、1I1B、1ALU、1ILK、1DOK、5OB5、3QXY、3ELJ、1PME、1FYH、1ICW，通過與核心活性成分進行分子對接，搜集Vina對接的結合能(kcal/mol)數值見表3所示，實驗結果顯示連樸飲核心成分與核心靶標分子對接的結合能數值均為負，提示核心靶標與主要活性成分均具有很好的結合性。

表3 分子對接得分信息Table 3 Molecular docking score information

3 討論

慢性胃炎是有多種病因引起的胃粘膜慢性炎癥反應[5]，是臨床常見病和多發病。由于該病慢性遷延的發病過程，并且由慢性萎縮伴腸上皮化生到內瘤變最終演化為惡性癌癥的風險較高，慢性胃炎-慢性萎縮性胃炎-胃癌轉化的“炎癌轉化”的模式越來越受到人們的普遍關注。近些年，課題組在“病證結合”模式下，借助代謝組學等技術方法證實慢性萎縮性胃炎中醫病機存在由濕熱致虛、再由濕熱致瘀的總體轉化趨勢，提出了清熱利濕、活血化瘀的治法[6]。連樸飲做為脾胃濕熱證的代表方劑，臨床研究發現以連樸飲為主方加減在改善慢性胃炎伴糜爛脾胃濕熱證的臨床癥狀、內鏡下黏膜表現、Helicobacterpylori根除率方面療效確切[7]。連樸飲與針刺結合西藥對胃痞病脾胃濕熱型的臨床療效顯著[8]。在實驗研究方面，有研究證實連樸飲可下調胃癌前病變大鼠胃黏膜IL-6、NF-κB水平的表達，可以減少胃黏膜的炎癥反應，調節胃黏膜細胞增殖與凋亡的失衡[8]。本研究發現IL6及NF-κB信號通路中關鍵因子RELA、IL1B、CXCL8、CXCL2均是連樸飲防治慢性萎縮性胃炎的核心靶標，從文獻的角度驗證了本研究的可靠性。

連樸飲為中醫苦泄法的代表方劑，方中黃連性味苦寒，入心、肝、胃大腸經可燥熱泄濕，現代藥理學研究證實黃連所含主要成分小檗堿對慢性萎縮性胃炎的主要致病菌(H.pylori)具有較強抑制作用[8,9]；厚樸性味苦辛溫，可行氣化濕，滌痰通滯，基于系統藥理學的厚樸藥理作用機制研究認為，厚樸主要成分皂苷類化合物、生物堿及揮發油等成分可以對胃腸動力、炎癥等起到重要的調節作用[10]；黃連與厚樸相配既能通降濕熱，又可升降氣機，共為君藥。豆豉苦寒入肺胃，可宣發郁熱，有研究發現豆豉主要成分黃豆黃素對人胃癌細胞有明顯的細胞毒作用，其作用機制可能與激活MAPK，抑制STAT3及NF-κB信號通路有關[11]；梔子苦寒清熱，瀉三焦火熱，有研究認為梔子所含槲皮素可能通過影響p38MAPK、BCL-2和BAX的水平，防止幽門螺桿菌感染引起的胃炎和凋亡[12]；石菖蒲辛溫，芳香化濁、開竅豁痰、理氣祛濕，Rahamooz等[13]發現石菖蒲活性成分可引起胃癌細胞起到阻滯和下調Oct4和NS基因的作用，能抑制HUVECs細胞的血管生成；半夏辛溫，燥濕溫中、理氣化痰、降逆止嘔、消痞散結，所含β-谷甾醇能抑制胃癌細胞增殖并促進其凋亡，其機制可能與通過PI3K/AKT/mTOR通路誘導細胞自噬作用有關[14]；蘆根甘寒，清熱利濕、生津止渴，研究發現所含豆甾醇在胃癌細胞SNU-1中，能上調BAX、下調BCL-2的表達、抑制癌細胞增殖和遷移，以及抑制JAK/STAT信號通路[15]。縱觀連樸飲全方，體現了分解濕熱、以及“宣上、暢中、滲下”的治療思想，為臨床防治慢性萎縮性胃炎的運用提供了參考依據。

本研究利用了網絡藥理學的研究方法，搜集連樸飲活性成分與靶標信息構建了成分靶標網絡，通過PPI、GO、KEGG富集分析發現其作用機制涉及多種生物學過程和多條信號通路，其中與慢性萎縮性胃炎“炎癌轉化”相關的代表性的免疫炎癥信號通路有：IL-17信號通路、TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、C型凝集素受體信號通路、Th17細胞分化信號通路等。目前研究證實白介素17信號通路在急性和慢性炎癥反應中都扮演著重要的角色，其家族信號(IL-17A-F組成)通過其相應的受體，激活下游通路，包括NF-kB、MAPKs和C/EBPs，誘導抗菌肽、細胞因子和趨化因子的表達[16,17]，IL-17F 6400A/G基因多態性與慢性萎縮性胃炎的發生風險顯著相關[18],而黃連素可能通過下調IL-6、IL-17的表達有效改善慢性萎縮性胃炎患者的臨床癥狀和病理分級[19]，這也從側面證實連樸飲可能通過調節IL-17信號通路中相關信號因子的表達對慢性萎縮性起到治療作用。Thl7細胞主要介導慢性炎癥，在慢性萎縮性胃炎“炎癌轉化”過程中發揮著重要作用，有研究證實Th17/IL-17可以促進H.pylori感染后的細菌定植以及炎癥的程度[20,21]，目前在連樸飲的臨床研究中發現連樸飲可對H.pylori感染陽性慢性胃炎具有顯著療效[22]，其如何通過Th17細胞分化途徑調控慢性萎縮性胃炎“炎癌轉化”進程有待進一步研究。慢性萎縮性胃炎作為胃癌前病變，在“炎癌轉化”進程中多種促炎細胞因子(如IL-1β、IL-8、IL-11、TNF-α、IFN-γ等)發揮著重要的作用，同時涉及到多條免疫炎癥信號通路，如本次富集分析中發現的Toll樣受體信號通路、C型凝集素受體信號通路等，通過分子對接實驗發現連樸飲與這些關鍵靶標具有很好的結合性，但同時需要進一步的研究探討連樸飲對這些靶標與通路調控表達的具體機制。

綜上所述，本次研究借助網絡藥理學和分子對接的技術方法，闡明了連樸飲活性成分、靶標、信號通路之間的相互作用，發現了多個靶標、信號通路等生物學過程，并進行了初步驗證，為今后的藥效機制實驗研究與臨床研究提供了參考依據。