基于流式細胞儀對杏屬植物基因組大小的測定

張俊環，楊 麗，姜鳳超，張美玲，孫浩元，王玉柱

(1.北京市林業果樹科學研究院，北京 100093；2.國家林業和草原局杏工程技術研究中心，北京 100093)

基因組大小(或稱C-值)是指單倍體細胞中全套染色體的DNA總量，以質量pg(Picogram)或堿基對數目Mb(Million base pair)為單位[1]，而1 pg相當于978 Mb[2]。流式細胞儀法由于方法簡便、快捷、靈敏度高、檢測結果穩定可靠，已成為測量植物基因組大小的主要手段[3-5]。用流式細胞儀檢測細胞DNA含量，通常采用特異的熒光染料碘化丙啶(Propidium iodide，PI)對其進行染色，PI通過均勻地插入雙鏈DNA的堿基對中，對細胞核DNA進行特異性染色，熒光分子結合DNA的量與細胞內DNA含量呈正比，通過檢測被激發的染色細胞發射的熒光強度，并與內參比較可換算出被測樣品的DNA含量[1]。近年來，多種植物在進行高通量測序之前，先通過流式細胞儀進行基因組大小的測定，以期為高通量測序文庫的構建和基因組組裝提供數據參考[6-8]。

杏(Prunusarmeniaca)是原產我國的特色果樹，我國杏栽培面積和產量均居世界首位。杏屬于薔薇科(Rosaceae)李屬(PrunusL.)李亞屬(Prunophora)杏組/屬(Armeniaca)植物，杏屬植物共有6～12個種[9]，其中普通杏(P.armeniaca)、西伯利亞杏(P.sibirica)、遼杏(P.mandshurica)和紫杏(P.dasycarpa)這4個種是杏生產中常見并得到公認的種類。另外，仁用杏(又稱大扁杏)被認為是由普通杏(P.armeniaca)和西伯利亞杏(P.sibirica)自然種間雜交形成的類型[10-11]。杏資源種類極其豐富，不同種類在生態適應性、形態特征等方面表現出多樣性，即使同一個種內，不同品種在某些性狀上的變異也較顯著。近年來，對這些杏屬植物的研究主要集中在遺傳多樣性、親緣關系以及分類地位等方面[12-14]，而針對它們基因組大小的分析鮮見報道。基因組反映了生物物種全部和特定的遺傳信息，基因組大小是植物最基本也是最重要的生物多樣性特征參數。因此，本研究用流式細胞儀，通過單獨進樣和混合進樣結果分析，篩選出理想的內參基因組，并以此為內參，測定分屬于普通杏、遼杏、西伯利亞杏、仁用杏和紫杏5個種的12個杏品種資源的基因組大小，并以引進的歐洲品種Canino為參照，比較不同種、變種及品種之間基因組大小的差異，以期為相關杏屬植物的物種進化和分類研究以及基因組研究提供基礎數據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試的13份杏資源(表1)分別屬于5個種和變種，其中普通杏4份(包括1份歐洲品種)、普通杏變種5份、西伯利亞杏1份、遼杏1份、紫杏1份、仁用杏1份。13份供試材料的嫩葉均采自北京市林業果樹科學研究院的杏資源圃，試驗作為內標的桃品種早艷、葡萄品種瑞都科美和棗品種金絲小棗的嫩葉均采自北京市林業果樹科學研究院的資源圃。

表1 供試的杏資源信息Tab.1 Information of tested apricot materials

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞核懸液制備 按照試劑盒Cystain?PI Absolute (sysmex)的說明書進行，取幼嫩、干凈的新鮮葉片，剪取小于0.5 cm2大小的新鮮嫩葉，放入培養皿中，加入500 μL提取緩沖液，用鋒利的刀片一次性快速切碎，材料整個過程浸沒在提取液里；完全切碎后再加入4 ℃下預冷的2 mL含有碘化丙啶(Propidium iodide, PI)12 μL和RNaseA 6 μL的染色液，之后立即用50 μmol/L濾膜過濾到5 mL收集管中，置4 ℃下避光染色1～2 h，獲得細胞核懸浮液，置于冰上備用。每個樣品設3個生物學重復。以二倍體的桃品種早艷、葡萄品種瑞都科美和棗品種金絲小棗分別做內標，篩選適宜的內標植物。

1.2.2 流式細胞儀檢測 用德國Partec流式細胞儀(CyFlow-Space)進行檢測，每組樣品至少收集10 000個粒子，然后根據內標植物和待測植物的核濃度，調整比例進行混合，使內標植物和代謝植物的核濃度盡量一致，再次共進樣檢測，流式細胞儀測定內標與待測植物的熒光峰圖，以FlowMax軟件進行數據分析，CV值控制在5%以內。

1.2.3 樣品基因組大小的計算 熒光信號的強度代表了細胞核內物質的濃度，與細胞核DNA含量呈正比。樣品的基因組大小按照以下公式計算：待測樣品基因組大小=(待測樣品熒光強度/內標樣品熒光強度)×內標植物基因組大小。

2 結果與分析

2.1 內標植物基因組的確定

以杏串枝紅、陜梅和大優佳杏為例，分別以二倍體葡萄品種瑞都科美、二倍體桃早艷和二倍體棗金絲小棗的基因組做內標，進行內標基因組的篩選。杏、葡萄、桃和棗的基因組大小測定結果如圖1，可見，在優化的試驗條件和儀器參數設定下，4種植物基因組的流式直方圖中均出現了清晰的吸收峰，并且，杏和桃的流式直方圖中均出現了雙峰(圖1-A、C)，且雙峰出峰位置比例保持較為穩定，通過計算發現，2個峰的道數值(出峰位置)呈2倍關系，由此可知，第1個峰代表的是G0/G1期的DNA含量，第2個峰代表的是G2/M期的DNA含量。流式細胞儀測定植物基因組大小，通常是通過比較G0/G1期的峰值來計算基因組大小。由圖1可知，杏、桃、葡萄和棗的G0/G1期峰的熒光強度值分別為119.93，103.54，190.86，176.99，根據基因組大小計算公式，在內標植物相同時，基因組大小與熒光峰值呈正比，由此判斷4種植物的基因組大小順序為桃<杏<棗<葡萄，與已經發表的這4種植物基因組大小順序相符(杏294 Mb、桃265 Mb、棗438 Mb、葡萄487 Mb)[1]。

圖1 杏、葡萄、桃和棗分別單獨進樣的流式細胞儀測試結果Fig.1 Flow cytometric fluorescent detection image of apricot, grape, peach and jujube

為了準確測定杏屬植物基因組的大小，避免流式細胞儀在不同時間點對PI核染色靈敏度的差異，一般采取測試植物樣品與內參樣品共進樣，在相同條件下同時測定待測植物與內標植物的熒光峰值，通過比值估測待測植物基因組的大小。杏與不同內參共進樣得到的混合峰如圖2所示。在優化的試驗條件下，混合樣品的吸收峰均可同時被檢測到，但是杏的細胞核和桃的細胞核卻不易分開，2C值吸收峰幾乎重疊(圖2-B)，因為二者的基因組大小比較接近。葡萄瑞都科美的2C熒光峰(G0/G1)位于杏的G0/G1期峰與G2/M期峰之間(圖2-A)，并且與杏細胞分裂的G2/M期幾乎重疊，互相干擾。由圖2-C可以看出，金絲小棗的2C值峰也位于杏的G0/G1期峰與G2/M期峰之間，但金絲小棗的基因組比葡萄小，它的G0/G1期峰的熒光強度值小于葡萄，故距離杏G2/M期峰相對稍遠，杏與金絲小棗混合樣品的檢測直方圖中無重疊峰，且區分度良好，可獲得較少雜峰的峰型圖。因此，選用基因組大小已知的金絲小棗作為內標，可保證測定杏屬植物基因組大小的合理性和準確性。通過比較單獨進樣和共進樣，確認杏和棗熒光峰的相對位置，從而估算杏基因組的大小。其他杏屬植物基因組的大小測定均以棗基因組做內參。

圖2 杏與葡萄、杏與桃、杏與棗合樣品流式細胞儀檢測結果Fig.2 The result of mixed samples of apricot with grape, peach or jujube, respectively

2.2 不同杏屬植物基因組大小的比較

以二倍體棗品種金絲小棗(C值0.44 pg，基因組大小為424 Mb)[2]為內標，通過比較待測樣品和內參G0/G1期峰，計算得出杏屬植物不同種和品種的基因組大小，發現杏屬植物的基因組大小在(245.07±0.842)～(300.60±1.181)Mb。杏屬植物不同種和品種間基因組大小均有一定的差異，其中所測試的5個種間的差異均達到了顯著水平。由表2可知，基因組相對較大的是普通杏變種陜梅，為(300.60±1.181)Mb，其次為串枝紅，基因組大小為(291.59±1.642)Mb，二者差異顯著且均顯著高于其他品種；然后依次是Ⅲ組(遼杏及普通杏變種賽買提和皮乃孜)，Ⅳ組(西伯利亞杏的綠萼山杏及普通杏品種駱駝黃和青蜜沙)，Ⅴ組(普通杏變種垂枝山杏和仁用杏品種龍王帽)，Ⅳ組(普通杏變種李光杏類型大優佳和普通杏歐洲品種類型卡尼諾)，組間差異均顯著但組內差異均不顯著；基因組相對較小的是紫杏(245.07±0.842)Mb ，顯著低于其他品種。在普通杏的3個品種中，駱駝黃與青蜜沙杏的基因組大小無顯著差異，但均顯著小于串枝紅杏。另外，同屬于李光杏類型的3個品種間也有一定的差異，賽買提和皮乃孜的基因組大小分別是(279.45±4.619)Mb和(278.36±0.859)Mb，二者無顯著差異，但均顯著大于大優佳杏。

表2 13個杏品種的基因組大小Tab.2 The genome size of 13 cultivars of P. armeniaca

3 結論與討論

基因組大小的測定一般采用內標法[5]，使用內標的分析能夠降低樣品制備以及儀器自身引起的誤差，因此更適用于精確的分析[15]。有研究表明，同一個植物類型材料，選擇的內標植物不同、測定方法不同(包括內標法和外標法、染色方法等)而得到大小不同的基因組測定值[2, 16-17]。內標植物的選擇對準確測定待測植物的基因組很重要[18]，本研究內標基因組的選擇標準，主要考慮了以下幾方面：已經發表基因組大小的二倍體果樹植物，基因組大小與杏基因組大小相差不是太大，但要保證2種材料的熒光峰(G0/G1期峰)不能重疊。在實際檢測時發現，可能是因為杏這一物種細胞分裂間期較短，杏材料同時出現了細胞分裂的G0/G1期(二倍體DNA)熒光峰和G2/M期(DNA加倍)熒光峰；因此，內參植物的熒光峰需要滿足與杏基因組的2個熒光峰均不重疊的條件。本研究中待測植物的2個熒光峰與金絲小棗測定的直方圖中熒光峰均無重疊，區分度良好，試驗結果準確可靠，故金絲小棗在本研究中是一種較為理想的內標植物。以金絲小棗為內參測定普通杏基因組大小為272.65～291.59 Mb，與以雞血紅細胞為內參測定杏基因組大小為294 Mb相接近[1]，這也表明本研究內標植物的選擇是準確可信的。

基因組大小是指真核生物單倍體基因組所含DNA的總量，可反映植物種間和品種間的差異[19-21]，本研究也得到了類似的結果。測試的杏5個種間基因組大小差異較大，達到了顯著水平，普通杏基因組相對較大，尤其是串枝紅杏(291.59 Mb)，紫杏基因組最小(245.07 Mb)；西伯利亞杏品種綠萼山杏與普通杏品種駱駝黃和青蜜沙差異不顯著，遼杏與普通杏變種賽買提和皮乃孜差異不顯著，兩組間差異小于其與紫杏之間的差異，說明普通杏與西伯利亞杏和遼杏的親緣關系較近，而與紫杏的親緣關系較遠，這與馮晨靜等[22]采用ISSR分析的結果相一致。另外，目前研究支撐杏屬植物的演化趨勢為：普通杏→遼杏→山杏[9]，從普通杏這一最原始的植物學種到山杏的進化過程中，基因組大小沒有明顯的變化，與沈慧等[23]在棗屬植物上的研究結果不一致，酸棗到棗的進化中則可能伴隨著基因組的縮減。“C值悖論”認為基因組的大小和物種的進化復雜度之間沒有嚴格的對應關系[24],因此，杏基因組大小與杏屬植物種類進化間的關系有待進一步的研究揭示。

同一種內不同變種類型的基因組大小差異也較大，普通杏的變種陜梅與垂枝山杏及李光杏類型(賽買提、大優佳和皮乃孜)的基因組大小差異均顯著，且李光杏類型中的賽買提和皮乃孜與大優佳的基因組大小差異亦達顯著水平，其中陜梅的基因組是所測13份杏材料中基因組最大的，達到了300.60 Mb。以李光杏類型中的大優佳品種為例，與普通杏變種陜梅進行比較，二者植物形態也差異較大，花、果實和葉片都明顯不同。陜梅杏在杏屬中花朵最大、花瓣最多、開花期最遲，適宜觀賞，很少結果實；屬于李光杏變種的大優佳的最大特點是果實表面光滑無毛，果實小，含糖量高，葉片小而厚，抗旱性強[25]。基因組大小與其表型性狀有著復雜的關系。關于基因組大小與植物表型之間的相關性研究較少，目前比較確定的觀點認為，基因組大小和細胞大小呈正相關關系[24,26]。DNA含量通過影響細胞大小和有絲分裂周期時間而影響表型，特別是在植物進化和適應性方面起著關鍵作用[17]。Knight等[27]研究得出相似的結果，基因組大小與細胞體積的大小、保衛細胞的長度以及表皮細胞面積等表型性狀相關性較強，而與單位面積葉質量、光合作用效率等表型相關性較弱。本研究基因組相對較小的大優佳杏原產我國新疆地區，新疆光照強、干旱少雨，為了適應這種自然環境，葉片變小、變厚，可能是由于葉片細胞體積的大小、保衛細胞的長度以及表皮細胞面積變小的結果。而細胞的大小是為了適應于基因組大小的改變而形成的被動改變[24]。基因組相對較大的陜梅杏花朵較大，其細胞大小是否大于同屬的其他種類和品種，仍有待進一步的研究。本研究對杏5個種或類型的13個變種或品種基因組大小的測定研究，可為杏屬植物基因組、轉錄組和資源的鑒定及分類等方面的深入研究提供參考。