脂肪間充干細(xì)胞復(fù)合骨軟骨一體化支架修復(fù)兔骨軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

杰永生，鄭蕊，陳磊，靳少鋒，孫磊，舒雄，綦惠

關(guān)節(jié)軟骨損傷是臨床上十分常見的病癥，也是骨科和運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)中公認(rèn)的治療難題之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，年齡范圍 15 ～ 24 歲的年輕人中有 4% ～ 10%，年齡超過 55 歲的老年人中有高達(dá) 80% 的人出現(xiàn)軟骨病變[1-2]。由于關(guān)節(jié)軟骨是一種無血管、無神經(jīng)的結(jié)締組織，細(xì)胞代謝緩慢，一旦缺損其自發(fā)修復(fù)和再生能力很差。目前臨床治療軟骨損傷的常用方法如關(guān)節(jié)腔灌洗清創(chuàng)、微骨折術(shù)、自體/異體骨軟骨移植，旨在減輕關(guān)節(jié)疼痛和緩解癥狀，并不能有效地促進(jìn)軟骨組織的修復(fù)再生；且這些方法存在很大的局限性，如供體部位損傷，效果不持久，排斥反應(yīng)等[3-5]。因此，尋找新型的、可有效促進(jìn)軟骨生理性再生修復(fù)的方法具有極其重要的臨床意義。

近年來，組織工程學(xué)這一新型邊緣交叉學(xué)科的出現(xiàn)為軟骨缺損的修復(fù)提供了廣闊的研究領(lǐng)域和應(yīng)用前景。脂肪組織中分離出的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose mesenchymal stem cells，ADSCs）表現(xiàn)出顯著更高的增殖率，并且特異性呈三種譜系的分化：成脂肪、成骨和成軟骨。與骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞相比較，ADSCs 易于分離和大量獲取，同時(shí)具有更好的分離重復(fù)性和更強(qiáng)的增殖能力，一直被認(rèn)為是最適合臨床應(yīng)用的細(xì)胞[6-7]。此外，我們前期研究已成功構(gòu)建脫細(xì)胞真皮基質(zhì)/生物礦化膠原骨軟骨一體化支架，具有良好的力學(xué)特征和生物相容性，有利于細(xì)胞的黏附與生長(zhǎng)，易生物降解吸收[8]。本實(shí)驗(yàn)建立以 ADSCs 復(fù)合脫細(xì)胞真皮基質(zhì)/生物礦化膠原骨軟骨一體化支架修復(fù)新西蘭兔的骨軟骨缺損的動(dòng)物模型，觀察其在軟骨缺損修復(fù)中的作用，為下一步臨床提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和設(shè)備 人脂肪組織來源于北京知音創(chuàng)美醫(yī)療美容門診部吸脂者，女性，抽吸部位為腹部，已獲得提供者知情同意，術(shù)后無菌保存。甲醛、蘇木精、伊紅購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；I 型膠原酶、胰酶、Trizol 試劑、高糖 DMEM、低糖 DMEM 和胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；抗兔 CD90、CD105、CD44、CD14、CD45 和 CD19 抗體購(gòu)自美國(guó) BD 公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó) Shellab 公司；往復(fù)式真空泵購(gòu)自上海 益化真空設(shè)備有限公司；倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本 Olympus 公司；冷凍大容量離心機(jī)購(gòu)自湖南湘儀；FACSCanto II 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó) BD 公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6 周齡，新西蘭大白兔 18 只，體重 2.0 ～ 2.5 kg，雌雄各半，購(gòu)買于北京金牧陽(yáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司，許可證號(hào)SYXK（京）2020-0002，飼養(yǎng)環(huán)境為普通級(jí)。

1.2 方法

1.2.1 一體化支架的制備 生物礦化膠原懸液作為一體化支架下層，脫細(xì)胞真皮基質(zhì)作為一體化支架上層。首先將冷凍干燥脫細(xì)胞真皮基質(zhì)放入聚丙烯圓筒形模具中（內(nèi)徑 5 mm；高 5 mm），將制備的生物礦化膠原懸液經(jīng)脫氣后，緩慢注入模具中。為使接觸界面緊密，使懸液固化成型，即在 -80 ℃ 冰箱內(nèi)維持 2 h，冷凍樣品最終在冷凍干燥機(jī)內(nèi)真空條件下冷凍干燥 48 h，脫模后成功取出支架。另將制作好的支架用 20 kGy60Co γ 射線輻照滅菌后，4 ℃ 條件下密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞分離及培養(yǎng) 無菌條件下取脂肪組織，將脂肪組織在 PBS 中清洗 3 次，徹底去除紅細(xì)胞與組織碎片。加入預(yù)熱的 0.1% I 型膠原酶 溶液，置 37 ℃ 水浴振蕩消化 1 h。300 × g 離心 5 min，去除上層脂肪細(xì)胞與膠原酶溶液。加入適量含 10% BSA 的 DMEM 重懸細(xì)胞，經(jīng) 100 μm 細(xì)胞篩過濾，調(diào)整細(xì)胞密度接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[7]。將獲得細(xì)胞培養(yǎng)到 P3 備用。

1.2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 新西蘭兔仰臥于手術(shù)臺(tái)上，四肢固定，耳緣靜脈注射 0.1% 的戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，膝外側(cè)切口，股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)面做直徑 4 mm 的圓形缺損，縱向鉆入 2 mm，深達(dá)軟骨下骨，造成骨軟骨缺損模型。模型兔隨機(jī)分成 3 組，每組 6 只，分別為空白對(duì)照組（僅作缺損，不進(jìn)行任何處理）、支架組以及支架聯(lián) 合 ADSCs 組，術(shù)后 6、12 周處死。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)北京積水潭醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2.4 主要觀察指標(biāo)

1.2.4.1 一般情況 動(dòng)物模型制備后，觀察 3 組新西蘭兔存活及飲食等情況。

1.2.4.2 國(guó)際軟骨修復(fù)協(xié)會(huì)組織學(xué)評(píng)分 6、 12 周取材后，按照國(guó)際軟骨修復(fù)協(xié)會(huì)（ICRS）標(biāo)準(zhǔn)（表 1）進(jìn)行大體評(píng)分。

1.2.4.3 大體觀察創(chuàng)面愈合情況 動(dòng)物模型制備后 6、12 周，3 組大體觀察創(chuàng)面愈合情況。

1.2.4.4 HE 染色 10% 甲醛固定、30% 脫鈣和石蠟包埋，垂直于缺損區(qū)進(jìn)行切片，HE 染色 5 min 后，在光鏡下觀察。

1.2.4.5 番紅 O-固綠染色 按照說明書進(jìn)行。切片常規(guī)脫蠟至水，入新鮮配制的 Weigert 染液染色 5 min。酸性分化液分化 15 s。固綠染色液內(nèi)浸染5 min，蒸餾水洗 1 min。Safranin O stain 內(nèi)浸染 2 min，蒸餾水洗 1 min。用弱酸溶液洗滌切片 1 min，蒸餾水洗 1 min。分別用 95% 乙醇、無水乙醇脫水，二甲苯透明，光學(xué)樹脂封固。

表1 軟骨損傷修復(fù)的大體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 ICRS macroscopic evaluation of cartilage repair

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用 SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以± s表示，兩組計(jì)量資料之間的比較采用 t 檢驗(yàn)，P ＜ 0.05 為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs 的分離和鑒定

細(xì)胞接種 24 h 后，圓形細(xì)胞下沉在瓶底呈圓形或多角形，48 ～ 72 h 細(xì)胞數(shù)量明顯增加，排列密集（圖 1）。5 ～ 7 d 時(shí)細(xì)胞明顯增多，大多數(shù)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形。傳至第 3 代細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞表型呈 CD34-、CD45-、HLA-DR-、CD73+、CD90+、CD105+（圖 2）。

2.2 ICRS 評(píng)分

ICRS 評(píng)分顯示，術(shù)后 6 周，一體化支架組與 ADSCs 復(fù)合一體化支架組的軟骨修復(fù)程度顯著優(yōu)于對(duì)照組（P ＜ 0.05），一體化支架組與 ADSCs 復(fù)合一體化支架組之間無顯著差別；術(shù)后 12 周，ADSCs 復(fù)合一體化支架組的軟骨修復(fù)程度顯著優(yōu)于對(duì)照組和一體化支架組（P ＜ 0.05）（表 2）。

2.3 大體觀

實(shí)驗(yàn)的新西蘭大白兔于手術(shù)后 6、12 周處死，對(duì)照組缺損內(nèi)無軟骨修復(fù)組織，部分僅有少量修復(fù)，但修復(fù)組織數(shù)量較少，起不到填充作用。一體化支架組缺損處部分修復(fù)，表面欠平整，凸凹不平，交界區(qū)界限明顯。ADSCs 復(fù)合一體化支架組缺損處幾乎填充完全，修復(fù)組織色澤、質(zhì)地同正常關(guān)節(jié)軟骨，表面光滑，與周圍正常軟骨組織界限模糊，結(jié)合緊密（圖 3）。

圖1 ADSCs 形態(tài)學(xué)觀察（倒置相差顯微鏡 × 40）（A：24 h；B：48 h；C：72 h）Figure 1 Morphology observation of the ADSCs (Inverted phase contrast microscope × 40) (A: 24 h; B: 48 h; C: 72 h)

圖2 ADSCs 表面特異性蛋白檢測(cè)Figure 2 Phenotype analysis of ADSCs

表2 ICRS 組織評(píng)分結(jié)果與比較Table 2 Histological scoring results and comparison

圖3 三組術(shù)后 6、12 周大體觀察Figure 3 General observation of wounds in three groups at 6, 12 weeks after operation

圖4 術(shù)后 6、12 周 HE 染色觀察（× 40）Figure 4 The HE observation in three groups at 6, 12 weeks after operation (× 40)

2.4 組織學(xué)染色

HE 染色顯示術(shù)后 6 周，對(duì)照組的缺損區(qū)域凹陷明顯，與周邊正常區(qū)域界限明顯；一體化支架組的缺損區(qū)域表面修復(fù)不平，纖維組織修復(fù)較為明顯；ADSCs 復(fù)合一體化支架組的缺損區(qū)域底部可見少量的柱狀排列的軟骨細(xì)胞以及多形核細(xì)胞。術(shù)后 12 周，對(duì)照組的缺損區(qū)域表面平坦，被纖維組織覆蓋；一體化支架組的缺損區(qū)域與正常組織區(qū)域處底部可見少量柱狀排列的軟骨細(xì)胞；ADSCs 復(fù)合一體化支架組的底部可見較多柱狀排列的軟骨細(xì)胞以及多形核細(xì)胞（圖 4）

圖5 術(shù)后番紅 O-固綠染色觀察（× 40）Figure 5 The safranine O-fast green stain observation at 6, 12 weeks after operation (× 40)

番紅 O 固綠染色術(shù)后 6 周，對(duì)照組缺損區(qū)域 未被番紅 O 著色，與呈紅色的正常軟骨組織界限明顯；支架組缺損區(qū)域也未被番紅 O 著色；一體化支架聯(lián)合 ADSCs 組，缺損區(qū)域底部可見微弱的番紅 O 著色。術(shù)后 12 周，對(duì)照組缺損區(qū)域表面被纖維組織覆蓋；一體化支架組缺損區(qū)域底部可見少量番紅 O 著色；一體化支架聯(lián)合 ADSCs 組，缺損區(qū)域底部可見明顯的番紅 O 著色，且在缺損與正常組織交界處底部有大量紅色的區(qū)域（圖 5）。

3 討論

近年來，骨軟骨損傷修復(fù)是骨科領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，由于關(guān)節(jié)軟骨自我修復(fù)能力較差，尤其針對(duì)大面積的軟骨缺損，同時(shí)伴有軟骨下骨的缺損。對(duì)此類損傷的修復(fù)十分棘手，目前研究報(bào)道一些相關(guān)軟骨修復(fù)的新方法也探索了軟骨相關(guān)的修復(fù)機(jī)制，在某種程度上存在優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用的可能性[9-10]。鑒于軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞黏附定植和增殖需要的材料孔隙不同，因此構(gòu)建可誘導(dǎo)軟骨與軟骨下骨生成的一體化骨軟骨支架就十分有必要。課題組已構(gòu)建脫細(xì)胞真皮基質(zhì)/生物礦化膠原一體化支架，其中真皮來源的細(xì)胞外基質(zhì)來源于動(dòng)物皮膚組織，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、移行及分化；下層起到支撐作用，具有很好的力學(xué)性能和成骨誘導(dǎo)性，是骨軟骨一體化多相支架骨層重要組成部分。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用一體化支架為骨軟骨缺損的動(dòng)物模型植入后，缺損處能夠得到較好的充填，達(dá)到一定程度的修復(fù)，但修復(fù)組織與正常透明軟骨相比仍具有差異。因此，本研究將一體化支架與脂肪干細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用，探討該方法對(duì)骨軟骨缺損的修復(fù)作用。結(jié)果表明，單純支架以及支架與脂肪干細(xì)胞聯(lián)合均能在術(shù)后 6 周即發(fā)揮促進(jìn)修復(fù)的作用，但兩者 ICRS 評(píng)分無顯著性差異，證明后者的優(yōu)勢(shì)并未顯現(xiàn)；術(shù)后 12 周，后者的 ICRS 評(píng)分顯著高于前者，證實(shí)其治療效果明顯優(yōu)于前者。HE 染色和番紅 O-固綠染色也證實(shí)，單純一體化支架以及 ADSCs 復(fù)合一體化支架均能夠促進(jìn)骨軟骨缺損的修復(fù)，在損傷部位與正常組織交界處，一體化支架組并未見到透明軟骨基質(zhì)產(chǎn)生，而 ADSCs 復(fù)合一體化支架組則已經(jīng)見到缺損區(qū)域底部出現(xiàn)透明軟骨基質(zhì)，且 ADSCs 復(fù)合一體化支架組的軟骨細(xì)胞增殖更活躍，已有柱狀排列的趨勢(shì)，與正常軟骨組織相似。因此，ADSCs 的加入將更有利于促進(jìn)骨軟骨缺損的修復(fù)。被認(rèn)為是對(duì)關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)起促進(jìn)作用的關(guān)鍵生長(zhǎng)因子，能夠刺激蛋白多糖與 II 型膠原的合成；誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化并表達(dá) II 型膠原和蛋白多糖；抑制金屬蛋白酶的表達(dá)從而抑制膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的降解；參與調(diào)節(jié)軟骨基質(zhì)的構(gòu)建或重構(gòu)。盡管本研究已經(jīng)證實(shí)一體化支架與脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用有利于骨軟骨缺損的修復(fù)，且缺損與正常組織交界處有新生的柱狀排列的軟骨細(xì)胞，但經(jīng)過 12 周的修復(fù)，仍未達(dá)到透明軟骨/透明軟骨樣修復(fù)的目標(biāo)。后續(xù)我們將延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間，進(jìn)一步觀察再生支架與脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用對(duì)骨軟骨缺損修復(fù)的最終結(jié)果。