蛇葡萄素對實驗性結腸炎大鼠Treg/Th17細胞分化的影響

王超 王曉娟 朱美榮 萬玉剛

[摘要] 目的 探討蛇葡萄素對實驗性結腸炎大鼠Treg/Th17細胞分化的影響。 方法 48只雄性SD大鼠采用隨機數字表法分為對照組，模型組、高、中、低劑量組和柳氮磺吡啶組，每組8只。除對照組外，其余5組大鼠均使用三硝基苯磺酸建立實驗性結腸炎模型。造模3 d后，藥物治療7 d，高、中、低劑量組大鼠分別灌胃給予500、250、125 mg/（kg·d）蛇葡萄素，柳氮磺吡啶組灌胃柳氮磺吡啶100 mg/（kg·d），對照組灌胃定量生理鹽水。比較6組轉化生長因子-β1（TGF-β1）、白細胞介素-10（IL-10）、IL-17、叉頭轉錄因子3（Foxp3）、信號轉導與轉錄活化因子5（STAT5）、維甲酸相關孤核受體γt（RORγt）、STAT3、IL-35表達水平。 結果 模型組病理損傷評分明顯高于對照組（P < 0.05）;高、中劑量組和柳氮磺吡啶組病理損傷評分低于模型組（均P < 0.05）。模型組TGF-β1、IL-10、IL-35、Foxp3、STAT5表達水平低于對照組，IL-17、RORγt、STAT3表達水平高于對照組（均P < 0.05）。高、中、低劑量組和柳氮磺吡啶組TGF-β1、IL-10、IL-35、Foxp3、STAT5表達水平高于模型組，IL-17、RORγt、STAT3表達水平均低于模型組（均P < 0.05）。 結論 蛇葡萄素可以調節實驗性結腸炎大鼠Treg/Th17細胞分化，增強細胞功能。

[關鍵詞] 蛇葡萄素;實驗性結腸炎;白細胞介素;轉錄因子;調節性T細胞;輔助性T-17細胞

[中圖分類號] R574.62? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）09（a）-0019-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of Ampelopsin on the differentiation of Treg/Th17 cells in experimental colitis rats. Methods Forty-eight male SD rats were divided into control group， model group， high dose group， medium dose group， low dose group and Sulfasalazine group by random number table method， with eight rats in each groups. Except for control group， the other five groups of rats were used Trinitrobenzene Sulfonic Scid to establish experimental colitis model. After three days of modeling， drug treatment was given for seven days. Rats in high， medium， and low dose groups were given 500， 250 and 125 mg/（kg·d） of Ampelopsin respectively， and Sulfasalazine group was given 100 mg/（kg·d） of Sulfasalazine， and control group was given quantitative normal saline. The levels of transformed growth factor-β1 （TGF-β1）， interleukin-10 （IL-10）， IL-17， forkhead box P3 （Foxp3）， signal transducers and activators of transcription 5 （STAT5）， retinoic related orphan receptor γt （RORγt）， STAT3 and IL-35 in six groups were compared. Results The pathological injury score of model group was higher than that of control group （P < 0.05）; and the pathological injury scores of high， medium dose groups and Sulfasalazine group were lower than those of model group （all P < 0.05）. The expression levels of TGF-β1， IL-10， IL-35， Foxp3 and STAT5 of model group were lower than those of control group， while the expression levels of IL-17， RORγt and STAT3 were higher than those of control group （all P < 0.05）. The expression levels of TGF-β1， IL-10， IL-35， Foxp3 and STAT5 of high， medium， low dose groups and Sulfasalazine group were higher than those of model group， while the expression levels of IL-17， RORγt and STAT3 were lower than those of model group （all P < 0.05）. Conclusion Ampelopsin can regulate Treg/Th17 cell differentiation and enhance cell function in experimental colitis rats.

[Key words] Ampelopsin; Experimental colitis; Interleukin; Transcription factor; Regulatory T cells; Helper T-17 cells

潰瘍型結腸炎（UC）是一種特發性慢性炎癥，與遺傳、菌群失調和免疫炎癥損傷等有關[1-2]。調節性T細胞（Treg）功能紊亂在UC發病中起到重要作用[3-4]，表現為Treg細胞比例下降，白細胞介素（IL）-17水平升高[5]。轉化生長因子-β1（TGF-β1）和IL-10由Treg細胞分泌，可以緩解UC結腸黏膜的炎癥反應[6]。此外，還有許多相關因子在UC發病的信號通路中發揮作用[7-8]。通過調節Treg細胞和Th17細胞之間的平衡來治療免疫炎癥性疾病是近年來研究的熱點。蛇葡萄素是從蛇葡萄莖葉中分離的一種多酚羥基雙氫黃酮醇，具有抗氧化、抗炎和免疫調節作用[9]。張亞兵等[10]發現，蛇葡萄素可以改善實驗性結腸炎大鼠血清和結腸組織超氧化物歧化酶水平，并減輕結腸炎性損傷。蛇葡萄素對UC的治療鮮有報道。本研究檢測了蛇葡萄素干預后結腸炎大鼠相關因子的表達水平，探討蛇葡萄素對Treg/Th17細胞分化的影響，為蛇葡萄素的應用提供理論基礎。

1 對象與方法

1.1 實驗動物

48只雄性SD大鼠，體重（357.23±21.34）g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證編號：11400700325314，許可證號為SCXK（京）2006～2009。動物飼養環境為：溫度（22±2）℃、濕度（50±10）%、明暗周期12 h/12 h，自由攝食和飲水。

1.2 實驗分組與處理

采用隨機數字表法將48只大鼠隨機分為對照組，模型組，高、中、低劑量組和柳氮磺吡啶組，每組8只。除對照組外，其余5組大鼠根據張亞兵等[10]的模型建立標準，用三硝基苯磺酸（201908213，Sigma）建立實驗性結腸炎模型。造模成功2 d后，進行藥物治療。高、中、低劑量組大鼠分別灌胃給予500、250、125 mg/（kg·d）蛇葡萄素（張家界至誠生物有限公司，20190211），2次/d[11];柳氮磺吡啶組灌胃柳氮磺吡啶（梯希愛化成發展有限公司，201509191）100 mg/（kg·d），2次/d;對照組灌胃定量生理鹽水（石家莊四藥有限公司，20190221），2次/d。所有大鼠均干預7 d。

1.3 觀察指標及檢測方法

1.3.1 病理觀察及評分? 取結腸組織制備石蠟切片，蘇木精-伊紅（HE）染色。顯微鏡（CX43，日本Olympus）下表現進行病理評分[12]，包括：無炎癥現象0分;極少白細胞浸潤1分;少量白細胞浸潤2分;較多白細胞浸潤，結腸壁增厚3分;結腸全壁有白細胞浸潤，杯狀細胞丟失，結腸壁增厚4分。

1.3.2 血漿及結腸組織相關蛋白表達水平? 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒檢測血漿中轉化生長因子-β1（TGF-β1，2018102312）、IL-10（ 2018102314）、IL-17（2018102321）、叉頭轉錄因子3（Foxp3，2018092234）、信號轉導與轉錄活化因子5（STAT5，20181092252）、維甲酸相關孤核受體γt（RORγt， 2019021671）、STAT3（2018102332）、IL-35（2018102335）水平及結腸黏膜組織TGF-β1、IL-10、IL-17、IL-35水平。試劑盒均購于武漢博士德生物有限公司，嚴格按照試劑盒說明書操作，ELX 800酶標儀（BioTek公司）檢測。

1.3.3 Western blot檢測大鼠結腸黏膜Foxp3和STAT5蛋白表達水平? 蛋白提取試劑盒（北京百奧萊博生物科技有限公司，019168）從結腸黏膜中提取總蛋白，樣品中加入SDS緩沖液煮沸5 min使蛋白變性。經凝膠電泳（SDS-PAGE）后將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，孵育一抗，4℃過夜，棄去一抗，TBST洗膜3次，每次5 min。室溫孵育二抗2 h，棄去二抗，TBST洗膜3次，每次5 min。ACCESS2全自動化學發光免疫分析儀（美國Beckman公司）顯色，以β-actin作為內參，計算Foxp3和STAT5蛋白條帶的灰度比值。

1.3.4 免疫組化SP法檢測結腸黏膜RORγt和STAT3蛋白表達水平? 制備結腸黏膜石蠟切片，二甲苯脫蠟，乙醇脫水，3%過氧化氫溶液浸泡10 min。將切片在PBS中煮沸30 min，載玻片在5% BSA中培養45 min，4℃下加一抗培養過夜，PBS洗滌3次后加入二抗，37℃下培養45 min。DAB顯色，通過復染、脫水、透明和封片等步驟后在顯微鏡下觀察。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析，計量資料多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色及6組病理評分比較

模型組大鼠鏡下可見嚴重上皮損傷，腺體結構破壞，炎癥細胞浸潤至黏膜下層。蛇葡萄素和柳氮磺吡啶均可改善上皮損傷，減少炎細胞浸潤，保護黏膜肌層，見圖1。模型組病理損傷評分高于對照組（P < 0.05），高、中劑量組和柳氮磺吡啶組病理損傷評分低于模型組（均P < 0.05）。見圖2。

2.2 ELISA試劑盒檢測6組血漿相關蛋白表達水平比較

模型組TGF-β1、IL-10、IL-35、Foxp3、STAT5表達水平低于對照組，IL-17、RORγt、STAT3表達水平高于對照組（均P < 0.05）;高、中、低劑量組和柳氮磺吡啶組血漿TGF-β1、IL-10、IL-35、Foxp3、STAT5表達水平高于模型組，IL-17、RORγt、STAT3表達水平均低于模型組（均P < 0.05）。見圖3。

2.3 ELISA試劑盒檢測6組結腸黏膜相關蛋白表達水平比較

模型組TGF-β1、IL-10、IL-35表達水平低于對照組，IL-17表達水平高于對照組（均P < 0.05）;高、中、低劑量組和柳氮磺吡啶組結腸黏膜中TGF-β1、IL-10、IL-35蛋白表達水平高于模型組，IL-17表達水平低于模型組（均P < 0.05）。見圖4。

2.4 Western blot檢測6組結腸黏膜Foxp3和STAT5表達水平比較

模型組Foxp3和STAT5表達水平低于對照組（均P < 0.05）;高、中、低劑量組和柳氮磺吡啶組Foxp3和STAT5表達水平高于模型組（均P < 0.05）。見圖5。

2.5 免疫組化SP法檢測6組結腸黏膜RORγt和STAT3表達水平比較

模型組RORγt和STAT3表達水平高于對照組（均P < 0.05）;高、中、低劑量組和柳氮磺吡啶組RORγt和STAT3表達水平低于模型組（均P < 0.05）。見圖6、圖7。

3 討論

Treg細胞功能缺陷和Th17細胞增多是UC免疫炎癥紊亂的重要原因[13-14]。Foxp3/STAT5通路和RORγt/STAT3通路均涉及Treg/Th17分化的調控[15-16]。在TGF-β1存在的條件下，原始T細胞表面IL-2R與IL-2結合后激活STAT5，促進Foxp3的轉錄，是原始T細胞分化為Terg并分泌IL-10[17-18]。Foxp3是Treg細胞分化所依賴的轉錄因子，其表達缺陷可導致腸黏膜發生嚴重的炎癥損傷[19-20]。與Terg類似的是，IL-6/IL-6R/STAT3信號通路和TGF-β1可誘導Th17細胞分化。STAT3的激活又可促進RORγt表達，其是Th17細胞發育重要的轉錄因子，并且可以促進IL-17的分泌[21-22]。

蛇葡萄素是黃酮類化合物，廣泛存在于藤茶、無刺根等植物，具有抗氧化、抗炎和免疫調節的作用[23-24]。既往蛇葡萄素的藥效學研究多集中于腫瘤[25]，而鮮有關于UC的報道。張亞兵等[10]發現，蛇葡萄素可以改善實驗性結腸炎大鼠血清和結腸組織超氧化物歧化酶水平，并減輕結腸炎性損傷。本研究首次發現，蛇葡萄素在改善實驗性結腸炎大鼠黏膜病理損傷的同時，可以下調促炎細胞因子的表達。為了證明蛇葡萄素對Treg/Th17細胞分化的影響，本研究檢測了血漿和結腸黏膜中Terg/Th17細胞相關分子的蛋白表達水平。研究結果顯示，高、中、低劑量組血漿TGF-β1、IL-10表達水平高于模型組，IL-17表達水平均低于模型組（均P < 0.05）。為了明確蛇葡萄素對Terg/Th17細胞平衡的影響，本研究檢測了IL-35、Foxp3/STAT5通路和RORγt/STAT3通路的表達情況。研究結果顯示高、中、低劑量組血漿IL-35表達水平高于模型組（P < 0.05），提示蛇葡萄素可促進Terg/Th17細胞分化。本研究結果顯示，蛇葡萄素可提高血漿和結腸組織Foxp3和STAT5表達水平，促進Treg細胞分化;下調RORγt和STAT3表達，抑制Th17細胞分化，進一步說明蛇葡萄素對Terg/Th17細胞分化有調節作用。

綜上所述，蛇葡萄素可以提高實驗性結腸炎大鼠IL-35表達水平，上調Foxp3和STAT5表達，下調RORγt和STAT3表達，進而調節Treg細胞和Th17細胞平衡，促進TGF-β1和IL-10分泌，抑制IL-17分泌，增強細胞功能。總而言之，蛇葡萄素可能通過調控Terg/Th17細胞分化而治療UC。

[參考文獻]

[1]? Reinisch W，Gottlieb K，Colombel JF，et al. Comparison of the EMA and FDA guidelines on ulcerative colitis drug development [J]. Clin Gastroenterol Hepatol，2019，17（9）：1673-1679.e1.

[2]? 盧燕，杜靜，趙景潤，等.雌激素對潰瘍性結腸炎患者NF-κB、IL-6及NO表達的影響[J].國際免疫學雜志，2019， 42（1）：38-44.

[3]? Yao J，Wei C，Wang JY，et al. Effect of resveratrol on Treg/Th17 signaling and ulcerative colitis treatment in mice [J]. World J Gastroenterol，2015，21（21）：6572-6581.

[4]? Cui H，Cai Y，Wang L，et al. Berberine regulates Treg/Th17 balance to treat ulcerative colitis through modulating the gut microbiota in the colon [J]. Front Pharmacol，2018，9：571.

[5]? Takahashi M，Nakamura K，Honda K，et al. An inverse correlation of human peripheral blood regulatory T cell frequency with the disease activity of ulcerative colitis [J]. Dig Dis Sci，2006，51（4）：677-686.

[6]? Li M，Eckl J，Geiger C，et al. A novel and effective method to generate human porcine-specific regulatory T cells with high expression of IL-10，TGF-beta1 and IL-35 [J]. Sci Rep， 2017，7（1）：3974.

[7]? Luo CT，Li MO. Transcriptional control of regulatory T cell development and function [J]. Trends Immunol，2013，34（11）：531-539.

[8]? Zongyi Y，Funian Z，Hao L，et al. Interleukin-35 mitigates the function of murine transplanted islet cells via regulation of Treg/Th17 ratio [J]. PLoS One，2017，12（12）：e0189617.

[9]? Tieng FYF，Latifah SY，Md Hashim NF，et al. Ampelopsin E reduces the invasiveness of the triple negative breast cancer cell line，MDA-MB-231 [J]. Molecules，2019，24（14）：2619-2626.

[10]? 張亞兵，張瑩雯，柯浩亮，等.蛇葡萄素對結腸炎模型大鼠血清和結腸SOD和MDA表達的影響[J].湖北中醫藥大學學報，2018，20（2）：13-17.

[11]? Osafo N，Obiri DD，Danquah KO，et al. Potential effects of xylopic acid on acetic acid-induced ulcerative colitis in rats [J]. Turk J Gastroenterol，2019，30（8）：732-744.

[12]? 趙海梅，鹿秀云，岳海洋，等.黃芪多糖對結腸炎小鼠結腸黏膜JAK/STAT信號的調控作用[J].中國藥理學通報，2018，34（1）：145-146.

[13]? Cheng G，Yu A，Malek TR. T-cell tolerance and the multi-functional role of IL-2R signaling in T-regulatory cells [J]. Immunol Rev，2011，241（1）：63-76.

[14]? Bacchetta R，Passerini L，Gambineri E，et al. Defective regulatory and effector T cell functions in patients with FOXP3 mutations [J]. J Clin Invest，2006，116（6）：1713-1722.

[15]? Limagne E，Thibaudin M，Euvrard R，et al. Sirtuin-1 activation controls tumor growth by Impeding Th17 differentiation via STAT3 deacetylation [J]. Cell Rep，2017，19（4）：746-759.

[16]? Ma H，Gao W，Sun X，et al. STAT5 and TET2 Cooperate to Regulate FOXP3-TSDR Demethylation in CD4+T Cells of Patients with Colorectal Cancer [J]. J Immunol Res，2018，2018：6985031.

[17]? Mao QF，Shang-Guan ZF，Chen HL，et al. Immunoregulatory role of IL-2/STAT5/CD4+CD25+Foxp3 Treg pathway in the pathogenesis of chronic osteomyelitis [J]. Ann Transl Med，2019，7（16）：384.

[18]? Peterson LB，Bell CJM，Howlett SK，et al. A long-lived IL-2 mutein that selectively activates and expands regulatory T cells as a therapy for autoimmune disease [J]. J Autoimmun，2018，95：1-14.

[19]? Whiteside TL. FOXP3+Treg as a therapeutic target for promoting anti-tumor immunity [J]. Expert Opin Ther Targets，2018，22（4）：353-363.

[20]? Deng G，Song X，Fujimoto S，et al. Foxp3 Post-translational Modifications and Treg Suppressive Activity [J]. Front Immunol，2019，10：2486.

[21]? Li ZH，Wang YF，He DD，et al. Let-7f-5p suppresses Th17 differentiation via targeting STAT3 in multiple sclerosis [J]. Aging（Albany NY），2019，11（13）：4463-4477.

[22]? Kaufmann U，Kahlfuss S，Yang J，et al. Calcium Signaling Controls Pathogenic Th17 Cell-Mediated Inflammation by Regulating Mitochondrial Function [J]. Cell Metab，2019，29（5）：1104-1118.

[23]? 李晨紅，王志正，陳培清，等.蛇葡萄素通過抑制自噬促進結腸癌HCT116細胞凋亡[J].腫瘤，2020，40（4）：245-256.

[24]? 周永，鄭金英，金小玲，等.PPARγ激活在蛇葡萄素抑制乳腺癌細胞增殖和誘導凋亡中的作用[J].第三軍醫大學學報，2018，40（13）：1185-1191.

[25]? 繆苗苗，吳勇杰，覃紅，等.蛇葡萄素鈉協同卡鉑體外誘導肺癌Lewis細胞凋亡研究[J].中國臨床藥理學與治療學，2016，21（11）：1271-1276.

（收稿日期：2020-04-09）