全普CBD 油大鼠灌胃長期毒性試驗研究

唐 敏，王振宇，郭 翀，項 偉，宋京風

（1） 云南省第二人民醫(yī)院麻醉科，云南昆明 650021；2） 昆明醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程中心，云南昆明 650500；3） 昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，云南昆明 650032；4） 云南省漢木森科技有限公司，云南昆明 650500；5） 昆明醫(yī)科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南昆明 650500）

大麻二酚 （cannabidiol，CBD）是大麻（Cannabis sativa） 提取物的主要成分之一。大麻中的主要活性成分是大麻素類化合物，目前已知天然大麻素有113 種[1-2]，四氫大麻酚（THC）、CBD含量最高[3]，是大麻中的主要化學成分。它們互為同分異構(gòu)體[4]。雖然THC 被認為是其最重要的活性成分，具有神經(jīng)活性，可用于治療癌癥引起的嘔吐，但THC 具有致幻作用，這成為許多國家禁種大麻的唯一原因[5]。與THC 不同的是，CBD 是大麻中的非成癮性成分，能阻礙THC 對人體神經(jīng)系統(tǒng)影響，并具有抗痙攣、抗風濕性關(guān)節(jié)炎、抗焦慮等藥理活性[6]。最近Daniel Friedman 等[7]發(fā)現(xiàn)全普CBD 油能夠有效治療難治性癲癇Lennox-Gastaut 綜合癥和Dravet 綜合癥。Fabricio 等[9]發(fā)現(xiàn)在治療難治性癲癇和兒童癲癇方面，全譜CBD 油較純品CBD 具有更好的臨床效果和更低的臨床用量。Schrader 等[8]發(fā)現(xiàn)THC 和CBD 的混合物治療EB 病毒引起的疼痛，相比于阿片類鎮(zhèn)痛藥物，其目前尚未發(fā)現(xiàn)成癮性和耐受性，且具有良好的止疼效果。這正符合了新藥研發(fā)高效、低毒的思路和目標。目前全譜CBD 的抗腫瘤、抑制精神疾病、抗氧化等藥理作用成為研究的熱點，但是，有關(guān)全譜CBD 油的毒性和安全性評價尚未見報道。為進一步研究其安全性，探索其給藥安全范圍，本研究對SD 大鼠連續(xù)經(jīng)口染毒13 周，恢復4 周的安全性進行評價研究，旨在研究全普CBD 油毒性的作用性質(zhì)、程度、量效和時效關(guān)系以及可逆性等，為臨床應用安全性及防治提供毒理學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試藥物全普CBD 油中含有CBD 化學成分約為67%，THC 含量低于0.2%，由云南省漢木森科技有限公司提供。

1.1.2 實驗動物160 只SPF 級SD 大鼠，來源于昆明醫(yī)醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滇） 2015-002，實驗動物使用許可證：SYXK（滇） 2015-002。飼養(yǎng)環(huán)境為SPF 級。

1.1.3 主要儀器Roche Cobas311 全自動生化分析儀；SysmexHST-302 血液分析儀；STAGO STA-R Evolution 血凝儀；Nikon ECLIPSE 50i 研究型系統(tǒng)生物顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 劑量設(shè)計臨床應用劑量[10-13]：本品臨床為口服用藥，臨床擬用量以CBD 算為30～200 mg/d，按60 kg 體重計算人用藥最大劑量為3.33 mg/(kg.d)。

急性毒性試驗：SD 大鼠急性毒性試驗最大耐受量（MTD） 以CBD 計算為837.5 mg/(kg.bw)。

1.2.2 分組適應性飼養(yǎng)后，選擇合格動物150只，雌雄各半隨機分為五組，每組30 只，實驗設(shè)全普CBD 油50、125、250 mg/kg 三個劑量組，以CBD 算為33.5、83.75、167.5 mg/kg，分別為臨床推薦劑量的10、25、50 倍，同時設(shè)玉米油溶媒對照，高壓滅菌水陰性對照，每天5 mL/kg 等容量灌胃一次。進行連續(xù)經(jīng)口染毒13 周，停藥恢復觀察4 周。

1.2.3 給藥及觀察檢測試驗期間密切觀察大鼠一般狀況，記錄每周動物的體重、攝食量。在給藥13 周及停藥后4 周，每組各解剖20、10 只大鼠，雌雄各半。采用腹主動脈采血做血液學及血清生化檢查。停藥觀察4 周做可逆性觀察。解剖并對主要臟器進行病理組織學檢查。

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 軟件統(tǒng)計分析，計量資料，符合正態(tài)分布，結(jié)果采用均數(shù)±標準差方式表示，多組間比較用單因素方差分析，方差齊性時兩兩比較用LSD 方法分析，方差不齊時用秩和檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 對大鼠一般狀況及體質(zhì)量的影響

大鼠灌胃給于全普CBD 油13 周和停藥恢復性觀察4 周內(nèi)，對照組和各給藥組大鼠精神狀態(tài)良好，行為活動、呼吸正常，唾液腺、淚腺等腺體未見有異常分泌，皮毛光滑，糞便和尿液也未見異常。全普CBD 油對各組大鼠體質(zhì)量增長變化未出現(xiàn)統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見圖1。

2.2 攝食量變化

給藥期各給藥組和溶媒對照組各時段雌、雄鼠攝食量均低于陰性對照組，比較均有顯著性差異（P＜0.05/0.01），恢復期各給藥組和溶媒對照組攝食量逐漸增加，見圖2。

2.3 血液學檢測結(jié)果

給藥末期和恢復期血液學指標各組間比較均無顯著性差異（P＞0.05），見表1，2。

圖1 CBD 油給藥13 周大鼠體質(zhì)量的經(jīng)時變化Fig.1 Effect of the full spectrume CBD oil on the changes of dodyweight of rats

圖2 全普CBD 油給藥13 周大鼠耗食量的經(jīng)時變化Fig.2 Effect of the full spectrume CBD oil on the changes of food consuptio

表1 全普CBD 油給藥末期對血液學指標的影響（）Tab.1 Effect of the full spectrume CBD oil haematological indexes after 13 weeks medication （）

表1 全普CBD 油給藥末期對血液學指標的影響（）Tab.1 Effect of the full spectrume CBD oil haematological indexes after 13 weeks medication （）

表2 全普CBD 油恢復期對血液學指標的影響（）Tab.2 Effect of the full spectrume CBD oil haematological indexes after withdrawing medication for 4 weeks（）

表2 全普CBD 油恢復期對血液學指標的影響（）Tab.2 Effect of the full spectrume CBD oil haematological indexes after withdrawing medication for 4 weeks（）

2.4 血清生化學及電解質(zhì)指標檢查結(jié)果

給藥末期谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、血清堿性磷酸酶（ALP），給藥中、高劑量組高于溶媒對照組，比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）；血清白蛋白（ALB）、甘油三脂（Tri）、尿素氮（Urea） 高劑量組低于溶媒和陰性對照組，比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）；血糖（GLU） 高、中、低劑量組均低于陰性對照組，比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）；血清Na+，Cl-高劑量組低于溶媒和陰性對照組，比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.01），K+高劑量組低于陰性對照組，比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。恢復期，除高劑量Tri 低于溶媒對照組外，其余各項檢查指標均恢復正常，給藥組與對照組比較無顯著性差異（P＞0.05），見表3，4。

表3 全普CBD 油給藥末期血清生化學檢查結(jié)果（）Tab.3 Effect of the full spectrume CBD oil serum biochemical indexes of rats after 13 weeks medication （）

表3 全普CBD 油給藥末期血清生化學檢查結(jié)果（）Tab.3 Effect of the full spectrume CBD oil serum biochemical indexes of rats after 13 weeks medication （）

與陰性對照組間比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與溶媒對照組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01。

表4 全普CBD 油恢復期血清生化學檢查結(jié)果（）Tab.4 Effect of the full spectrume CBD oil serum biochemical indexes of rats after withdrawing medication for 4 weeks （）

表4 全普CBD 油恢復期血清生化學檢查結(jié)果（）Tab.4 Effect of the full spectrume CBD oil serum biochemical indexes of rats after withdrawing medication for 4 weeks （）

2.5 臟器重量及系數(shù)

給藥末期雌、雄鼠肝臟重量及系數(shù)高、中劑量組，肝腦系數(shù)，高、中、低劑量均高于溶媒和陰性對照組，比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.01/0.05），脾臟重量、系數(shù)及脾腦系數(shù)高、中劑量組低于溶媒和陰性對照組，比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.01/0.05）。恢復期各劑量組各臟器重量、系數(shù)及臟腦系數(shù)均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見表5～表10。

2.6 對肝臟的病理組織學檢查結(jié)果

給藥末期高劑量組部分動物（7/10），中劑量組部分動物（5/10）、可見肝細胞脂肪變性，肝細胞胞漿可見大小不等的圓形空泡（圖3、圖4），圖5 為正常的肝組織，且給藥中、高劑量組與對照組比發(fā)生率有顯著性差異（P＜0.05）。部分可見肝細胞點狀壞死、小灶炎，心臟局部間質(zhì)有少量淋巴細胞為主的炎細胞浸潤，此病理改變屬大鼠常見自發(fā)性病理改變。

表5 全普CBD 油給藥末期對雌鼠臟器系數(shù)的影響[g/100 g，（）]Tab.5 Effect of the full spectrume CBD oil organ coefficients of the female rats after 13 weeks medication[g/100 g，（）]

表5 全普CBD 油給藥末期對雌鼠臟器系數(shù)的影響[g/100 g，（）]Tab.5 Effect of the full spectrume CBD oil organ coefficients of the female rats after 13 weeks medication[g/100 g，（）]

與陰性對照組間比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與溶媒對照組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01。

表6 全普CBD 油給藥末期對雄鼠臟器系數(shù)的影響[g/100 g，（）]Tab.6 Effect of the full spectrume CBD oil organ coefficients of the male rats after 13 weeks medication[g/100 g，（）]

表6 全普CBD 油給藥末期對雄鼠臟器系數(shù)的影響[g/100 g，（）]Tab.6 Effect of the full spectrume CBD oil organ coefficients of the male rats after 13 weeks medication[g/100 g，（）]

與陰性對照組間比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與溶媒對照組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01。

表7 全普CBD 油恢復期對雌鼠臟器系數(shù)的影響[g/100 g，（）]Tab.7 Effect of the full spectrume CBD oil organ coefficients of the female rats after withdrawing medication for 4 weeks [g/100 g，（）]

表7 全普CBD 油恢復期對雌鼠臟器系數(shù)的影響[g/100 g，（）]Tab.7 Effect of the full spectrume CBD oil organ coefficients of the female rats after withdrawing medication for 4 weeks [g/100 g，（）]

表8 全普CBD 油恢復期對雄鼠臟器系數(shù)的影響[g/100 g，（）]Tab.8 Effect of the full spectrume CBD oil on organ coefficients of the male rats after withdrawing medication for 4 weeks[g/100 g，（）]

表8 全普CBD 油恢復期對雄鼠臟器系數(shù)的影響[g/100 g，（）]Tab.8 Effect of the full spectrume CBD oil on organ coefficients of the male rats after withdrawing medication for 4 weeks[g/100 g，（）]

表9 全普CBD 油給藥末期對大鼠臟腦比的影響[g/g，（）]Tab.9 Effect of the full spectrume CBD oil on Viscera/brain coefficients after 13 weeks medication[g/g，（）]

表9 全普CBD 油給藥末期對大鼠臟腦比的影響[g/g，（）]Tab.9 Effect of the full spectrume CBD oil on Viscera/brain coefficients after 13 weeks medication[g/g，（）]

與陰性對照組間比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與溶媒對照組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01。

表10 全普CBD 油恢復期對大鼠臟腦比的影響[g/g，（）]Tab.10 Effect of the full spectrume CBD oil on Viscera/brain coefficients after withdrawing medication for 4 weeks[g/g，（）]

表10 全普CBD 油恢復期對大鼠臟腦比的影響[g/g，（）]Tab.10 Effect of the full spectrume CBD oil on Viscera/brain coefficients after withdrawing medication for 4 weeks[g/g，（）]

圖3 全普CBD 油高劑量組肝臟輕度脂肪變性（HE 40×）Fig.3 Liver is mildly steatotic in CBD high group（HE 40×）

圖4 全普CBD 油中劑量組肝臟輕度脂肪變性（HE 40×）Fig.4 Liver is mildly steatotic in middle group （HE 40×）

3 討論

3.1 體重及攝食量

本研究對SD 大鼠連續(xù)經(jīng)口染毒13 周，恢復4周的安全性進行評價研究。試驗期間，每天觀察大鼠的外觀、行為等表現(xiàn)，整個試驗過程中各劑量組大鼠未出現(xiàn)死亡情況，且所有大鼠的行為、精神狀態(tài)、飲飼等無異常。給藥期及恢復期，各劑量組動物體重呈穩(wěn)步上升趨勢，符合正常生長規(guī)律[15-16]。給藥各劑量組攝食量有所降低，但降低程度與溶媒對照組相當，原因主要考慮溶媒植物油對大鼠食欲、消化功能的影響，而非全普CBD油本身的毒性所致。

圖5 CBD 油低劑量組肝臟小灶炎（HE 40×）Fig.5 Liver has focal inflammation in CBD low group（HE 40×）

圖6 溶媒組正常肝組織（HE 40×）Fig.6 Liver is normal in solvent group （HE 40×）

3.2 血液學及血清生化指標

給藥末期和恢復期對大鼠采血進行血液學和血清生化學檢測。給藥末期和恢復期血液學指標各組間比較均無顯著性差異。

血清生化指標，ALT、AST 和ALP 等生物酶學指標，是評價肝細胞損傷的敏感指標[17-19]，大多數(shù)情況下ALT 和AST 升高程度與肝細胞受損程度相一致，是目前最常用的肝功能檢測指標。給藥末期，給藥高、中劑量組血清中ALT、ALP 明顯升高，ALB 降低，提示服用全普CBD 油用高、中劑量組藥物時對可能引起肝細胞損傷，但停藥后該影響即消失，提示在后期的研究和臨床應用過程中注意監(jiān)測肝功能變化。

血清K+、Na+、Cl-對保持細胞外液容量、調(diào)節(jié)酸堿平衡、維持正常滲透壓和細胞生理功能有重要意義，并參與維持神經(jīng)肌肉的正常應激性。而本研究中、高劑量K+、Na+、Cl-及高劑量組血清Tri、Urea 低于陰性對照或溶媒對照組，GLU 高、中、低劑量組均低于陰性對照組，但降低程度較低，是其藥理作用的延申或毒性作用，可以通過增加劑量或延長給藥時間來進一步研究判斷。

3.3 臟器重量、臟器系數(shù)和病理組織學檢查

給藥末期雌、雄鼠肝臟重量及系數(shù)高、中劑量組，肝腦系數(shù)，高、中、低、劑量均高于溶媒和陰性對照組，比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.01/0.05），且具有劑量-反應關(guān)系。病理組織學顯示高、中劑量組均出現(xiàn)肝臟的輕度脂肪變性，且高劑量組發(fā)生率增加。脾臟重量、系數(shù)及脾腦系數(shù)高、中劑量組低于溶媒和陰性對照組，比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.01/0.05），但毒性判斷必須綜合考慮脾臟重量的劑量相關(guān)性及組織病理學改變才具有一定的毒理學意義[20]。該研究血液學、血清生化學和病理組織學檢查未發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)性變化，因此無毒理學意義。恢復期各劑量組各臟器重量、系數(shù)及臟腦系數(shù)均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。本實驗表明全普CBD 油無毒反應劑量為50 mg/kg，相當于人體推薦用量的10 倍以下為安全劑量，但在臨床應用過程中需要密切監(jiān)測肝功變化。