miR-429-5p 調控Bcl2 的表達參與脊髓損傷過程中神經元細胞凋亡的機制

陶裕川，易 勇，周世軍，王 翰

（宜賓市第二人民醫院神經外科，四川宜賓 644000）

腦和脊髓損傷（spinal cord injury，SCI） 是交通事故中最常見的損傷之一，其病理改變主要包括神經元和膠質細胞的壞死和凋亡[1]。近年來，脊髓損傷后微小RNA （microRNA） 的異常表達已成為潛在的研究熱點，然而，對其背后的機制仍知之甚少[2]。筆者研究了miR-429-5p 在脊髓損傷后的表達變化及其對脊柱神經元細胞的凋亡的影響，并探討miR-429-5p 在脊髓損傷中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

50 只Sprague-Dawley 成年健康（SD） 大鼠，雌雄不限，體重200～220 g。

1.2 大鼠背根神經節細胞的培養

大鼠背根神經節細胞購于美國Sciencell 公司。F12 完全培養基（購于Gibco） 重懸，細胞懸液過200 目細胞篩，接種細胞至六孔板內，每孔接種105個細胞，37℃、5%二氧化碳培養箱內培養。培養24 h 后細胞開始貼壁，折光性良好，細胞呈錐形并長出小突起；3 d 時細胞形態完全長開，胞體增大，長出明顯的軸突和樹突，換液并加入3 μg/mL 的阿糖胞苷（購于Sigma） 繼續培養；隨后每2 d 換液一次，直至細胞融合度80%～90%時培養完成。受損組細胞待培養至對數生長期后將培養液換為加入含有150 μmol/L H2O2的無血清培養液培養24 h。miR-429-5p Inhibitor 組細胞在受損模型建立后依據說明書進行質粒的轉染。提取蛋白并測定蛋白濃度，通過BCA 法蛋白定量后通過Western blot 法測Bcl2 蛋白表達水平。

1.3 熒光定量PCR 檢測

實驗通過熒光定量PCR 檢測miR-429-5p 及其候選靶基因Bcl2 轉錄水平的差異。mRNA 水平檢測采用GAPDH 作為內參基因，miRNAs 水平檢測采用U6 作為內參基因。熒光定量PCR 擴增引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR 擴增引物列表Tab.1 Nucleotide sequences of the primers used for real-time quantitative PCR

1.4 細胞凋亡檢測

凋亡檢測試劑盒購于東仁化學。根據試劑盒說明書操作后使用流式細胞分選儀下檢測細胞凋亡情況。同時，通過Western Blot 法測Caspase3 的蛋白表達水平。

1.5 模型建立

隨機將動物分為三組：正常（Control） 組，模型（Model） 組，miR-429-5p Inhibitor （model+miR-429-5p Inhibitor） 組。正常組（10 只）：SD 大鼠不做處理。模型組（20 只）：SD 大鼠以10%水合氯醛（0.4 mL/100 g） 腹腔注射麻醉成功后，以T10錐體棘突為，以T10椎體棘突為中心，咬除T10棘突及椎板，暴露硬脊膜，應用自制打擊器打擊，大鼠出現一過性的后肢痙攣和尾巴擺動即造模成功，依次縫合。miR-429-5p Inhibitor 組（20 只）：SD 大鼠建模后第1，3，5 天通過尾部靜脈注射80 mg/kg 的miR-429-5 pInhibitor。建模7 d后處死老鼠。

1.6 標本的獲取與切片

動物處死后，截取損傷（T10脊髓） 節段下約1 cm 的脊髓，4%多聚甲醛溶液固定，蔗糖梯度脫水，冰凍切片。

1.7 BBB 評分

模型建立后第1、3、7 天，通過Basso，Beattieand Bresnahan （BBB） 對脊柱損傷后模型的運動能力進行評分[3]。在分數評估期間，以大鼠的大鼠的后肢運動，穩定性，協調性，踩踏，軀干位置，腳趾間隙，腳掌位置和尾巴位置等為評分標準，采用雙人在均不知道實驗分組的前提下進行雙盲獨立觀察，評分結果取均值。組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

1.8 HE 染色與嗜銀染色

切片脫水，包埋后待用，一部分用于HE 染色，經二甲苯脫蠟后使用蘇木精染色5 min，分別浸入酸水及氨水中分色5 min，流水沖洗1 h，待沖掉染色劑后置于蒸餾水片刻，依次浸入70%，90%酒精中各10 min，予以酒精伊紅染色液染色2 min。另一部分用于嗜銀染色，具體操作參考實驗試劑盒說明書。

1.9 統計學處理

2 結果

2.1 miR-429-5p 的表達

qPCR 的結果顯示，當背根神經節細胞受損，miR-429-5p 的表達顯著上升，而受損細胞受到miR-429-5p Inhibitor 的刺激后，miR-429-5p 的表達明顯下降（P＜0.05），見圖1。

圖1 miR-429-5P 在背根神經節細胞受損時表達顯著上升Fig.1 The expression of miR-429-5p significantlyincreased when dorsal root ganglion cells was damaged*P ＜0.05。

2.2 miR-429-5p 對背根神經節細胞的凋亡的影響

為進一步研究miR-429-5p 對背根神經節細胞的凋亡的影響，采用流式細胞儀驗證HepG2 細胞凋亡，以此探討miR-429-5p 是否可以誘導脊髓神經細胞的凋亡。對照組中背根神經節細胞凋亡比率為（4.483±0.087） %，相較于正常背根神經節細胞，當背根神經節細胞受損時，細胞凋亡率明顯上升，為（32.00±1.585） %，而當受損細胞受到miR-429-5p Inhibitor 的刺激后，細胞凋亡率有明顯下降，為（16.667±0.653） %，（P＜0.05 見圖2。同時，通過Western blot 檢測了細胞凋亡相關因子Caspase3 的表達，與對照相比，背根神經節細胞損傷后Caspase3 的表達明顯上升，而miR-429-5p 的表達下調后Caspase3 的表達明顯下降（P＜0.05），見圖3。

2.3 BCL2 是miR-429-5p 的靶向因子

為探究miR-429-5p 對脊髓損傷的作用機制，本文通過TargetScan 數據庫預測發現miR-429-5p的靶基因可能為 Bcl2，雙熒光素酶檢測miR-429-5p 及BCL2 的作用關系。雙熒光素酶實驗的結果顯示，當細胞轉染了克隆有Bcl2 3’-UTR 質粒后，miR-429-5p 過表達組熒光素酶活性明顯受到抑制（P＜0.05），與對照組相比較差異明顯。而轉染克隆有Bcl2 3’-UTR 突變型質粒后，miR-429-5p 組熒光素酶的活性值之間無明顯差異。因此證明了Bcl2 與miR-429-5p 之間的靶標關系，見表2、圖4。

同時，Bcl2 的蛋白表達水平也通過Western blot 進行檢測。結果顯示，與空白對照組相比，Bcl2 的表達在背根神經節細胞損傷后明顯升高。在miR-429-5p Inhibitor 的刺激下，Caspase3 的表達明顯回升，再次驗證了Bcl2 是miR-429-5p 的靶蛋白（圖5）。

圖2 miR-429-5p 參與調控脊髓神經細胞的凋亡Fig.2 miR-429-5p regulated the cell apoptosis of spinal neurons*P ＜0.05。

圖3 miR-429-5p 調控Caspase3 的表達Fig.3 miR-429-5p regulated the expression of caspase 3*P ＜0.05。

表2 TargetScan 數據庫查詢預測miR-429-5p 的靶基因為Bcl2Tab.2 Bcl2 was predicted as the target gene of miR-429-5p via TargetScan database

圖4 相對熒光活性證明Bcl2 是miR-429-5p 的靶基因Fig.4 Relative luciferase activity showed Bcl2 was the target of miR-429-5p*P ＜0.05。

圖5 Bcl2 的蛋白表達受miR-429-5p 的調控Fig.5 miR-429-5p regulated the expression of Bcl2*P ＜0.05。

2.4 脊髓損傷后大鼠BBB 評分

術后1 d，除正常組外，SCI 模型組及miR-429-5p Inhibitor 組大鼠后肢運動均基本喪失，后肢處于完全麻痹狀態，對疼痛刺激反應遲鈍甚至無反應。術后7 d，SCI+miR-429-5pinhibitor 模型組大鼠的后肢運動能力恢復程度明顯高于SCI 模型組，見圖6。

2.5 miR-429 -5p 及BCL2 在脊髓損傷后大鼠中的表達

取損傷處脊髓樣本，通過qPCR 檢測大鼠脊髓損傷后miR-429-5p 及Bcl2 的表達變化。結果顯示，相比正常組，脊髓損傷7d后，miR-429-5p的表達顯著上升，而Bcl2的表達明顯下降。當miR-429-5p的表達下調時，Bcl2的表達有明顯回升，見圖7。

圖6 BBB 評分Fig.6 BBBscore*P ＜0.05。

圖7 miR-425-5p 以及Bcl2 在脊髓損傷模型中的表達Fig.7 Expressions of miR-425-5p and Bcl2 in spinal cord injury model*P ＜0.05。

2.6 Caspase3 在脊髓損傷后大鼠中的表達

脊髓損傷后，凋亡相關因子Caspase3 的表達有明顯上升，而miR-429-5p 的表達下調使Caspase3 的表達有明顯減弱。再次證明miR-429-5p參與調控脊髓細胞損傷后的細胞凋亡，見圖8。

2.7 嗜銀染色和HE 染色

脊髓損傷7 d 后，模型組大鼠脊髓損傷區可見少量的再生神經纖維，且迂回雜亂。而miR-429-5p Inhibitor 組可見大量明顯神經纖維（見圖9A～C）。同時，HE 染色結果顯示，模型組損傷部位局部結構紊亂，細胞走向無序，可見局部空洞，而miR-429-5p Inhibitor 的刺激使空洞明顯減少（見圖9D～E）。

圖8 caspase3 在脊髓損傷后大鼠中的表達Fig.8 Expression ofcaspase3 in spinal cord injury model*P ＜0.05。

圖9 嗜銀染色和HE 染色（×200）Fig.9 Nerve silver staining and hematoxylin-eosin (HE) staining （×200）

3 討論

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI） 可分類為原發性損傷和繼發性損傷。原發性損傷不可逆，而對于繼發性損傷，科學家們發現適當條件下脊髓有神經細胞再生，意味著SCI 有恢復的可能[4-6]。然而，不同于外周神經損傷，由于大量起源于大腦的皮層運動神經纖維和起源于背根神經節神經元的感覺神經纖維存在于脊髓中，脊髓損傷后功能的恢復依賴于感覺纖維和運動纖維的再生，因此，中樞神經系統損傷后的再生十分困難[7]。筆者通過檢測miR-429-5p 在脊髓損傷中表達的變化，以及miR-429-5p 對脊髓神經細胞凋亡以及神經纖維再生的影響，發現miR-429-5p 通過靶向BCL2抑制脊髓損傷后神經細胞再生的過程。

大量研究表明，miRNAs（MicroRNAs） 作為參與調控個體發育，細胞凋亡、增殖、分化和疾病的發生等生命活動的內源性新型非編碼小RNA，在許多疾病中發揮重要作用。在不同的疾病組織中，miRNAs 基因表達水平明顯不同，因此miRNAs 通過調控其靶基因的表達而使疾病癥狀產生差異[8-10]。miR-429-5p 在人體腫瘤的發生和發展、炎癥和纖維化、生殖以及細胞增殖、凋亡的調控中起重要作用[11]。然而，對于，對于miR-429-5p 在脊髓損傷中的表達與其作用機制卻仍然知之甚少。筆者的研究結果發現，當脊髓神經細胞受到損傷，miR-429-5p 的表達明顯上升。作為驗證，損傷處脊髓的qPCR 的結果也表明脊髓損傷7 d 后，miR-429-5p 的表達顯著上升。Li 等[12]發現，lncRNA Mirt2 通過下調miR-429 的表達減輕脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 導致的脊髓損傷。這與我們的實驗結果一致。同時，miR-429-5p inhibitor的刺激使神經細胞受損后的凋亡程度明顯降低，且通過BBB 評分發現脊髓損傷大鼠雙后肢功能得到較高程度的恢復，神經纖維數量增多，表明了miR-429-5p 參與調控受損神經細胞的凋亡，下調miR-429-5p 的表達可減少神經細胞的凋亡。

脊髓損傷后，多種凋亡信息傳入，大量的凋亡相關基因被激活，Bcl2（B-celllymphoma/leukemia 2） 是其中主要的抗凋亡因子。大量研究表明，Bcl-2 在脊髓損傷后有明顯下降[13-15]，這與筆者的研究結果一致。有關Bcl2 抗凋亡的作用機制，有以下幾種：（1） 抑制鈣離子的釋放[16]；（2） Bcl2通過阻止促凋亡基因信號傳遞或阻止誘導基因產物發揮作用；（3） Bcl2 通過抑制自由基而發揮抗凋亡作用[17]。結果表明，Bcl2 是miR-429-5p 的靶基因，且當miR-429-5p 的表達受到抑制，Bcl2 在脊髓損傷模型中的表達明顯上升，可推測miR-429-5p 通過調控Bcl-2 的表達來調控脊髓細胞的凋亡，從而參與脊髓損傷的再生過程。