不明原因反復胚胎種植失敗與子宮內膜CD38、CD138 表達的相關性

萬瑞雪，陳靜思，別 嘉，蘇 婭，孟昱時

（1） 昆明醫科大學第一附屬醫院生殖醫學科，云南昆明 650032；2） 昆明醫科大學第二附屬醫院生殖醫學科，云南昆明 650101）

體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET） 技術的不斷進步使不孕癥患者的臨床妊娠率大大提高，但仍有部分女性在接受多次胚胎移植后仍為獲得臨床妊娠，反復種 植 失 敗 （recurrent implantation failure，RIF）現在是輔助生殖技術發展中遇到的難點問題，在輔助生殖助孕中RIF 發生率約為10 %[1-3]。目前RIF 的定義尚未統一，一種是至少2 次胚胎移植未獲得妊娠者，另一種是進行了至少3 次胚胎移植未獲得妊娠者，而現在僅2 次胚胎移植后未獲得妊娠者被大部分RIF 治療方法的實驗研究作為研究對象[4]。RIF 病因尚未明確，排除胚胎染色體異常外現已闡明的部分如淋巴細胞亞群比例和功能失調、母體中自身抗體、促炎因子濃度升高均可以影響子宮內膜容受性和胚胎發育，使患者發生RIF。子宮動脈重鑄不足和血栓前狀態也一樣影響胚胎著床[5]。

近年來多項研究表明子宮內膜炎性改變與女性不孕、反復流產患者存在相關性。慢性子宮內膜炎（chronic endometrial，CE） 是指持續存在的子宮內膜炎癥，一般人群中的CE 患病率現不明確，大概0.8%～27.1%，但在不孕患者中明顯升高，約2.8%～26.8%，在復發性流產患者中的發病率高達9.7%～67.6%[6-9]。但是探討CE 與RIF 的關系的研究并不多，根據其病理狀況可以考慮CE 和RIF 的發生可能有一定的聯系，因此，本研究旨在探討RIF 與子宮內膜CD38、CD138 表達的相關性，從而探究RIF 的發生是否與CE 的存在相關性，為更全面的思考RIF 的病因和治療方案提供依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2017 年1 月1 日至2017 年12 月31 日在昆明醫科大學第一附屬醫院生殖醫學科行IVF-ET多次種植失敗的患者72 例。

納入標準：RIF 組為多次移植的胚胎數量≥10個或移植了至少兩次優質胚胎仍未獲妊娠患者，且年齡≤37 歲。對照組為男性因素不孕，第一周期行IVF-ET 獲得妊娠者，且年齡≤37 歲。所有患者均在IVF-ET 前一周期自愿接受宮腔鏡檢查并簽署知情同意書。

排除標準:影響胚胎著床的因素如輸卵管積水、生殖系統解剖結構異常、自身免疫性疾病、卵巢功能不良、內分泌疾病等。

1.2 子宮內膜組織獲取

所有患者均在月經干凈3～7 d，在常規消毒下刮取性宮腔鏡檢查并刮取子宮內膜，排除宮腔粘連、內膜息肉、縱隔子宮及其他解剖結構異常。刮取的內膜組織立即放入70%乙醇固定液中，24 h內行常規脫水，石蠟包埋，切片，分別行HE 染色和S-P 免疫組化染色。

1.3 子宮內膜組織學觀察及CD38、CD138 的測定

1.3.1 閱片觀察間質細胞的CD38、CD138 染色是否陽性，并計數每個高倍視野陽性細胞數。記錄：記錄所觀察的數據及患者子宮內膜組織病理學診斷。

1.3.2 CD38、CD138 陽性的判讀標準漿細胞胞膜在CD38、CD138 免疫組化染色后可顯示強陽性，胞質染色后則顯示為弱陽性，視野下可見到細胞質呈嗜堿性，染色質粗，沿核膜呈輻射狀排列成車輪狀，核圓但偏于細胞一側。慢性子宮內膜炎的診斷為每400 倍高倍鏡視野下，子宮內膜間質中見到5 個或以上典型的漿細胞。

1.4 統計學處理

統計分析采用SPSS 軟件包進行，計量資料符合正態分布以均值±標準差表示，采用兩獨立樣本t檢驗進行比較，計數資料用率表示，采用卡方檢驗比較，定性變量分布的比較采用卡方檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 比較RIF 組及對照組患者一般情況

兩組年齡、BMI、基礎FSH、HCG 日內膜厚度差異均無統計學意義（P＞0.05），見表1，具有可比性。

表1 RIF 組與對照組一般情況比較（）Tab.1 General characteristic’s comparison of RIF and control group （）

表1 RIF 組與對照組一般情況比較（）Tab.1 General characteristic’s comparison of RIF and control group （）

2.2 兩組患者宮腔鏡檢查及常規病理檢查的比較

在72 例RIF 患者中，有5 例宮腔鏡手術醫師在術中見內膜間質水腫伴充血，提示子宮內膜炎可能；41 例對照組患者中有2 例術中可見內膜水腫伴散在微小乳頭狀突起，提示子宮內膜炎可能，兩組差異不具有統計學意義（P＞0.05）。兩組患者常規病理報告均提示增生期或分泌期子宮內膜，未見異常病理報告。

2.3 子宮內膜CD38、CD138 陽性表達率與不明原因RIF 的相關性

72 例RIF 患者中共41 例CD38 表達為陽性（占56.9%）；共42 人CD138 表達陽性（占58.3%）；共48 例CD38 或CD138 表達陽性（占66.7%）。41 例對照組患者中共15 例CD38 表達陽性（占36.6%）；共16 例CD138 表達陽性（占39.0%）；共18 例人CD38 或CD138 表達陽性（占43.9%）。RIF 組CD38 陽性表達率及CD138 陽性表達率均高于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；RIF 組CD38 或CD138 陽性表達率也高于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 RIF 組與對照組子宮內膜CD38、CD138 陽性表達率的比較［n（%）］Tab.2 Expression rate of endometrium CD38 and CD138 in RIF and control group ［n（%）］

2.4 子宮內膜CD38、CD138 陽性表達率與不同種植失敗次數的相關性

RIF 患者中共37 例胚胎種植失敗2 次，其中共16 例CD38 表達陽性（占43.2%）；共17 例CD138 表達陽性（占45.9%）；共18 例CD38 或CD138 表達陽性（占48.6%）。胚胎種植失敗3 次的患者共24 例，其中共15 例CD38 表達陽性（占62.5%）；共17 例CD138 表達陽性（占70.8%）；共19 例CD38 或CD138 表達陽性（占79.2%）。種植失敗次數大于3 次的患者共11 例，其中10 例CD38 表達陽性（占90.9%）；8 例CD138 表達陽性（占72.7%）；共11 例CD38 或CD138 表達陽性（占100%）。

不同種植失敗次數患者組間比較，隨種植失敗次數增加CD38 及CD138 的陽性表達率也增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）；同時隨種植失敗次數的增加CD38 或CD138 的陽性表達率也增加，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 不同種植失敗次數患者CD38、CD138 陽性表達率的比較［n（%）］Tab.3 Comparison of different time's implantation failure patients with CD38 and CD138 expression rate ［n（%）］

2.5 CD38、CD138 細胞表達量與不同胚胎種植失敗次數的相關性

對種植失敗2 次、3 次、＞3 次三個組的陽性細胞表達量分為＜100 個、100～300 個、＞300 個三個水平，行秩和檢驗顯示種植失敗次數越多CD38、CD138 陽性細胞表達量就越高，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表4。

采用秩和檢驗行3 組的組間比較，種植失敗大于3 次的CD38、CD138 陽性細胞表達量均高于種植失敗3 次組和種植失敗2 次組，差異具有統計學意義（P＜0.05） ；種植失敗2 次與3 次間陽性細胞表達量不具有統計學差異（P＞0.05）。

表4 不同種植失敗次數患者CD38、CD138 表達量的比較Tab.4 Comparison of expression level of CD38 and CD138 in patients with different time's implantation failur

3 討論

在IVF-ET 周期中RIF 的患病率約10%，但RIF 的定義現尚未統一，歐洲人類生殖和胚胎學在2005 年將RIF 定義為累積移植大于等于10 枚高質量胚胎均未著床，或胚胎植入3 次以上為著床者；本研究中選擇了至少2 次胚胎移植，有優質胚胎而未獲得妊娠者作為研究對象。

現有的研究將RIF 的病因歸納為胚胎因素、免疫、代謝、凝血、子宮解剖結構異常幾個方面[10]，排除母體免疫、凝血等問題后CE 引起的胚胎種植失敗近年來得到了生殖醫學專家的關注。子宮內膜炎的主要發病原因是病原微生物感染，但急性子宮內膜炎與CE 是不同的治病原體感染引起，現運用基因組學、微生物組學技術可以有效的檢測CE 的致病原體[11]。存在炎癥的子宮內膜都有漿細胞浸潤和IgM、IgG 和IgA 抗體的分泌，這些炎性因子的存在改變子宮內膜的免疫環境，從何產生的免疫反應和炎癥反應會殺滅精子并呈現出胚胎毒作用，導致子宮內膜容受性下降，不利于胚胎的種植和發育。除此之外近期國外學者研究發現CE 也可能通過影響間質細胞蛻膜化從而影響胚胎植入[12]。因此早發現、早治療CE 對改善不孕、復發性流產及RIF 患者的妊娠結局是有幫助的。

現國內外學者對RIF 的病因研究多關注免疫、凝血等方面的因素，因CE 常無特異性的臨床表現，有時會忽略了CE 引起的RIF。本研究中在宮腔鏡檢查中及常規病檢HE 染色均顯示RIF 組與對照組患者間的異常率無統計學差異，可見單純在宮腔鏡檢查中依靠肉眼辨識及傳統HE 染色的方法無法提高CE 的檢出率。CE 在宮腔鏡下的表現為子宮內膜間質水腫，可見＜1 mm 的微小息肉及局部或散在的內膜充血[13]。CE 在HE 染色鏡下可見內膜增多和擴張的血管，存在浸潤在間質中的漿細胞及淋巴細胞。但由于內膜中白細胞的存在干擾及以及組織切片中細胞著色不足等原因，子宮內膜間質中的單核細胞、成纖維細胞在常規的HE染色中難以和漿細胞區分[14]。因此CE 的診斷需要尋找特異性高的標志物。

目前大量研究表明CD38，CD138 是漿細胞中最特異性表達物。使用免疫組織化學染色檢測二者能大幅度提高漿細胞的檢出率，優于傳統的HE染色[15]。因此子宮內膜是否有炎性改變可以用CD38、CD138 免疫組化染色來檢測，最終提高CE的確診率[16]。但目前通過檢出漿細胞診斷CE 還不足夠為CE 的治療提供依據，同時進行微生物組學檢測可以確認內膜微生物群成分，有助于明確微生物對內膜產生的免疫機制及導致CE 發生的機制，并對使用針對性的抗生素治療CE 起到指導作用[17]。

本研究通過CD38、CD138 細胞在RIF 患者子宮內膜中的陽性表達，研究發生RIF 與子宮內膜CD38、CD138 陽性表達的相關性，從而對RIF 與子宮內膜炎性改變的關系進行探討。研究結果顯示對照組子宮內膜中CD38、CD138 的陽性表達率低于RIF 組，并且在RIF 的患者中子宮內膜CD38、CD138 的陽性表達率就越高種植失敗的次數也就越多。再比較RIF 組CD38、CD138 的陽性細胞表達量，結果顯示種植失?。? 次的患者陽性細胞表達量明顯高于種植失敗2 次和3 次的患者。由此說明子宮內膜CD38、CD138 的陽性表達與RIF 的發生存在相關性，也從而證實了RIF 與CE有關，并且子宮內膜炎性改變的程度越重則胚胎反復種植失敗的次數越多，即胚胎種植越難。

根據現有的研究可以證實CE 和RIF 的發生存在相關性，那么對存在CE 的RIF 患者進行治療后對助孕結局是否有改善呢? Cicinelli、Mettao[18]等根據子宮內膜微生物的培養結果對伴有CE 的RIF 患者使用相應抗生素進行單獨或聯合用藥治療，結果顯示使用抗生素治療1～3 個療程后治愈CE 的患者人數為28%、23%和25%，剩余25%患者產生耐藥。抗生素治療后再次行新鮮胚胎移植的活產率治愈組（60.9%） 高于持續CE 組（13.3%）。Hartnett J[19]等對伴有CE 的RIF 患者使用多西環素治療后，免疫組化檢查發現CD138 基質中漿細胞清除率達70%，治愈組第一周期移植活產率32.8%，3 個累積移植周期活產率為38.8%?，F抗生素治療以及是治療CE 的一線方式，我中心現使用甲硝唑和地塞米松宮腔上藥聯合口服抗生素的治療方案對RIF 伴CE 的患者進行治療，本研究入組患者治療后第一周期胚胎移植臨床妊娠率為35.4%（17/48），因部分患者失訪及依從性較低未能統計活產率及累積妊娠率。除抗生素作為一線治療方式，部分臨床醫生使用中藥或聯合物理治療CE，也可以使RIF 及RSA 患者獲得理想的妊娠結局。

綜上所述，不明原因反復胚胎種植失敗與子宮內膜CD38、CD138 的陽性表達具有相關性；且反復種植失敗次數越多，CD38、CD138 陽性表達率及細胞表達量就越高；對不明原因反復胚胎種植失敗的患者通過免疫組化染色檢測子宮內膜CD38、CD138 的表達，有助于確診CE 引起的RIF。確診后使用抗生素同時聯合物理及中藥治療有利于改善RIF 患者的妊娠結局。但本研究樣本量有限，可能存在一定的局限性，今后還需要擴大樣本量進一步研究。