丹參酮ⅡA亞微乳逆轉腫瘤多藥耐藥的研究

馮 欣

(南陽醫學高等專科學校，河南 南陽 473000)

近年來，隨著我國腫瘤的發病率和死亡率不斷提升，腫瘤防治研究是當前醫學的重要研究內容[1]。腫瘤臨床治療失敗的主要原因可能是腫瘤細胞對化療藥物產生廣泛的耐藥作用，致使腫瘤細胞逐漸喪失對結構與藥理作用機制完全不同的化療藥物的敏感性。尋找多藥耐藥逆轉劑是克服腫瘤臨床耐藥、提高腫瘤化療敏感性的關鍵。我國中藥資源豐富，其中可能的腫瘤多藥耐藥逆轉劑具有多靶點、療效高、不良反應少等獨有的特點，引起研究者的廣泛關注。丹參酮ⅡA具有廣泛的抗腫瘤活性，參與抑制血管生成、抑制腫瘤侵襲和轉移、逆轉腫瘤多藥耐藥等多個環節[2]。研究[3]證明，丹參酮ⅡA亞微乳在體外能夠部分逆轉SMMC-7721/VCR的多藥耐藥性，但是其作用機制尚不清楚，本文模擬臨床常用紫杉醇聯合5-氟尿嘧啶及順鉑方案，觀察了丹參酮ⅡA亞微乳對小鼠S180多藥耐藥腹水癌多藥耐藥相關耐藥蛋白表達或活性的影響,以探討其干預化療多藥耐藥的作用和具體機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑丹參酮ⅡA原料藥(含量：98%，批號20140227)，四川省廣漢市世享原料藥業有限公司；丹參酮ⅡA亞微乳，由丹參酮ⅡA、豆卵磷脂(上海太偉藥業有限公司，藥用口服級)、玉米油、吐溫80和適量純水制成，丹參酮ⅡA濃度100 mg/mL。DMEM培養基，北京Solarbio科技責任有限公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司；Anne xin V-FITC凋亡檢測試劑盒，南京凱基生物科技有限公司；流式細胞儀，美國BD Biosciences公司；注射用順鉑(批號：01611611)，山東齊魯制藥廠；5-氟尿嘧啶(批號：100112)，天津金耀氨基酸有限公司；注射用環磷酰胺(批號：080503)，上海華聯制藥有限公司。

1.2 實驗動物昆明種小鼠，體質量19～24 g，由河南醫藥科學研究所提供；小鼠S180腹水癌模型，由河南醫藥科學研究所提供。

1.3 儀器CO2培養箱，法國Forme公司；680型全自動酶標儀、DK-8D型電熱恒溫水槽，上海晶宏實驗設備有限公司；倒置顯微鏡，德國Leica公司；1-15PK型臺式高溫冰凍離心機，美國Sigma公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 小鼠S180多藥耐藥腹水癌模型的建立[4]在無菌條件下，抽取3只小鼠S180的腹水，置于離心管中，采用無菌生理鹽水將含瘤細胞密度稀釋至1×107個/mL，混勻，分別腹腔接種至10只昆明種小鼠(雌雄各5只)，接種體積為0.2 mL。接種24 h后，除正常對照組外，腹腔注射或灌胃給予多種化療藥物，具體如下：順鉑3 mg/kg，腹腔注射，每周1次；環磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)和5-氟尿嘧啶各3 mg/kg灌胃，每天1次。待接種第15天，無菌條件下抽取存活小鼠的腹水，進行一對一傳代接種至新的昆明種小鼠腹腔，建立小鼠S180多藥耐藥腹水癌模型。

1.4.2 丹參酮ⅡA亞微乳抑瘤率觀察 1)造模：抽取已建立的小鼠S180多藥耐藥腹水癌模型腹水，采用無菌生理鹽水將含瘤細胞密度稀釋至1×107個/mL備用。取40只19～24 g昆明種小鼠，雌雄各20只，將稀釋好的腹水接種于每只小鼠左腋皮下，接種體積為0.2 mL，建立小鼠S180多藥耐藥實體瘤模型；2)小鼠分組及給藥：隨機將已建模成功小鼠分為4組，每組10只，即陽性對照組(經腹腔注射CTX 20 mg/kg)，陰性對照組(經腹腔注射無菌生理鹽水0.2 mL/10 g)，丹參酮ⅡA亞微乳大、小劑量組。丹參酮ⅡA亞微乳大、小劑量組給予相應濃度的丹參酮ⅡA亞微乳0.2 mL/10 g、0.1 mL/10 g，腹腔注射，每天給1次，共2周；3)計算丹參酮ⅡA亞微乳抑瘤率：末次給藥24 h之后，將小鼠實施安樂死，剝離腫瘤組織，稱其體質量，記錄瘤質量，按照以下公式計算抑瘤率：(對照組瘤質量-藥物組瘤質量)/對照組瘤質量×100%；藥物對抑瘤作用的提高率按照以下公式進行計劃：(藥物組抑瘤率-對照組抑瘤率)/對照組抑瘤率×100%。

1.4.3 流式細胞儀檢測丹參酮ⅡA亞微乳對SMMC-7721/VCR細胞凋亡的影響 選取無細胞毒性作用的0.5 μg/mL丹參酮ⅡA亞微乳分別作用于SMMC-7721/VCR細胞24 h、48 h、72 h，每組均設有陰性對照。藥物處理結束后，用不含乙二胺四乙酸的質量分數0.25%預冷胰酶消化各組細胞，并將其轉移至15 mL離心管中，800 r/min，離心5 min，棄上清液留細胞。向離心管中加入約5 mL預冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)，反復輕柔吹打，混勻，800 r/min，離心5 min，重復2次，棄去上清液留取底部細胞。按照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行流式細胞儀上機前處理：將收集得到的藥物處理后的細胞，加入適量Binding Buffer液，輕柔吹打，制成細胞懸液，調整細胞濃度凋整至(1～5)×106個/mL。取500 μL細胞懸液至EP管中，分別依次加入Annexin V-FITC和PI各5 μL輕柔吹打，混勻，置于室溫，避光反應15 min。將獲得的細胞懸液于200目尼龍網過濾，轉移至流式檢測管中，1 h內上流式細胞儀，檢測各組細胞不同時期的細胞凋亡率，記錄丹參酮ⅡA亞微乳作用下早期細胞凋亡率。采用以下條件進行檢測：激發波長=488 nm，發射波長=525 nm，通過BD FACSDiva軟件進行參數獲取和數據分析，實驗重復3次。

1.4.4 流式細胞儀檢測丹參酮ⅡA亞微乳對耐藥細胞膜表面耐藥相關蛋白P-gp表達的影響 將SMMC-7721、SMMC-7721/VCR細胞接種至6孔板，接種密度為2×105個/孔，24 h后待細胞貼壁后，于SMMC-7721/VCR細胞中加入0.5 μg/mL丹參酮ⅡA，以不加丹參酮ⅡA的SMMC-7721、SMMC-7721/VCR細胞作為陰性對照。作用48 h后，按照2.3中流式細胞儀檢測處理方法收集消化細胞、離心、預冷PBS洗2遍，棄上清留細胞，用含體積分數10%胎牛血清的預冷PBS將細胞濃度調整至(1～5)×105個/mL，輕柔吹打混勻，取細胞懸液90 μL，加入10 μL鼠抗人P-gp抗體，反復輕柔吹打，使細胞充分混勻，置于 4 ℃冰箱孵育30 min。取出細胞，離心，棄上清，用含體積分數10%胎牛血清的預冷PBS反復洗3次，從而除去未與蛋白結合的游離抗體。離心，棄上清，500 μL預冷PBS重懸細胞，細胞處理整個過程應于冰上進行。取200目尼龍網過濾的細胞懸液置于流式檢測管中，按照2.3中條件設置流式細胞儀參數，并進行數據分析，檢測到的P-gp熒光強度反應細胞內P-gp含量，實驗重復3次。

1.4.5 羅丹明外排實驗 羅丹明作為P-gp的轉運底物能較好代表其轉運功能[5-6]，因此，為了檢測丹參酮ⅡA對SMMC-7721/VCR細胞P-gp的影響是否與轉運功能相關，我們進行了羅丹明外排實驗。將SMMC-7721/VCR細胞以2×105個/孔接種于24孔培養板，24 h待細胞貼壁后，吸棄上清液，PBS洗2次，加入終濃度為5 μg/mL的羅丹明于37 ℃孵育30 min，棄去上清，加入丹參酮ⅡA亞微乳至終濃度為0.5 μg/mL，對照組更換成新鮮培養基，分別于0、0.5、1、2 h收取細胞。收集方法參照2.3，離心后棄上清，加入500 μL預冷PBS重懸細胞，于流式細胞儀檢測，激發波長480 nm，發射波長540～660 nm，細胞內羅丹明濃度以熒光強度平均值表示。

2 結果

2.1 丹參酮ⅡA亞微乳對小鼠多藥耐藥模型抑瘤率的影響與陰性對照組及陽性對照CTX組比較，丹參酮ⅡA亞微乳作用后，實體瘤質量顯著降低，抑瘤率明顯提高(P均<0.05)。見表1。

表1 丹參酮ⅡA亞微乳對小鼠多藥耐藥模型抑瘤率的影響

2.2 丹參酮ⅡA亞微乳誘導發生早期細胞凋亡情況0.5 μg/mL丹參酮ⅡA亞微乳作用SMMC-7721/VCR細胞24、48、72 h后,早期細胞凋亡率隨丹參酮ⅡA亞微乳作用時間的延長而增加，且實驗組較陰性對照組明顯(P均<0.05)。見表2。

表2 丹參酮ⅡA亞微乳作用不同時間段SMMC-7721/VCR早期細胞凋亡率 %

2.3 丹參酮ⅡA亞微乳抑制多藥耐藥細胞膜表面P-gp情況SMMC-7721細胞P-gp相對含量明顯低于SMMC-7721/VCR細胞，SMMC-7721/VCR+丹參酮ⅡA亞微乳細胞(0.5 μg/mL丹參酮ⅡA亞微乳作用48 h后)，細胞膜表面P-gp相對表達量與SMMC-7721/VCR細胞比較，有一定程度的降低，但仍高于SMMC-7721細胞(P均<0.05)。見表3。

表3 各組細胞膜表面P-gp相對量比較

2.4 丹參酮ⅡA抑制SMMC-7721/VCR細胞內羅丹明外排情況丹參酮ⅡA亞微乳組羅丹明濃度在每個時間段均顯著高于丹參酮ⅡA組，提示丹參酮ⅡA亞微乳可以明顯抑制細胞內羅丹明的外排(P均<0.05)。見圖1。

圖1 羅丹明外排實驗結果

3 討論

本研究結果表明，丹參酮ⅡA亞微乳能提高對小鼠S180多藥耐藥實體瘤的抑瘤率，并且隨著濃度的升高，抑瘤率有所提高，這說明丹參酮ⅡA亞微乳能逆轉小鼠S180腫瘤獲得性多藥耐藥。目前，已知腫瘤細胞多藥耐藥的機制多樣且復雜，P-gp具有轉運蛋白表達增高、功能活躍的特點，是化療耐藥的經典機制[7]。P-gp具有生物膜泵功能，可以將細胞內藥物泵至細胞膜外，從而降低細胞內的藥物濃度[8-9]。通過檢測丹參酮ⅡA亞微乳對P-gp表達的影響以及羅丹明外排的研究發現，抑制P-gp的外泵功能是其機制之一[10]。除此之外，流式細胞儀檢測丹參酮ⅡA亞微乳對SMMC-7721/VCR細胞凋亡的實驗表明逆轉腫瘤多藥耐藥機制可能與其提高耐藥細胞早期細胞凋亡率有關。通過本研究可以看出，運用丹參酮ⅡA亞微乳逆轉多藥耐藥有廣泛應用前景。我們由此推測出，丹參酮ⅡA亞微乳可以使細胞膜表面P-gp的含量降低，P-gp的轉運功能下降，腫瘤細胞對相關化療藥物的外排作用明顯減少，細胞內化療藥物濃度提高，可以部分逆轉SMMC-7721/VCR的多藥耐藥性。本實驗僅初步研究了丹參酮ⅡA亞微乳對P-gp表達的影響及多藥耐藥對耐藥細胞早期凋亡的影響，下一步我們將繼續探索丹參酮ⅡA亞微乳逆轉腫瘤多藥耐藥的作用及具體機制。