三葉青多糖對人肝癌細胞凋亡誘導作用及機理研究

戴慶福 林玉梅 王玉霞 高珊珊 曹慧敏 陳開紅

肝癌是人體常見的惡性腫瘤之一，位列消化道腫瘤死亡第一位。常規治療以手術和放化療為主，但不可避免的骨髓抑制、免疫力低下、胃腸道反應等毒副作用使得治療難度加大。肝作為人體解毒器官，通過減少藥物攝入量和降低藥物的活性等方式來提升抗藥性的研究，使得中醫藥治療領域中，抗腫瘤藥物為患者疾病治療提供了新的路徑[1]。三葉青即金線吊葫蘆，最初用于治療高熱、肝炎、風濕性關節炎及病毒性腦膜炎等疾病，后在動物實驗研究中，被納入抗腫瘤常用藥物中并取得了一定的成效。究其原因在于三葉青總氨基酸、多糖的含量之于肝癌細胞HepG2 信號轉導途徑的效果上[2]。本研究為三葉青多糖對人肝癌細胞凋亡誘導作用及機理，特選取2019 年4 月—2020 年3 月以來我院收治76 例肝癌患者的臨床資料為樣本勘驗對象，現就具體實驗結果總結分析如下。

1 基本資料和方法

1.1 基本資料

應用醫學研究勘驗對比法，選取2019 年4 月—2020 年3 月以來我院收治76 例肝癌患者的臨床資料，按照介入治療環節是否應用三葉青多糖，等分為對照組（未施用組，CTX 環磷酰胺）和試驗組。其中對照組男21 歲，女17 歲，年齡在43～67 歲，平均年齡（55.01±0.11）歲, Zung 抑郁自評量表（SDS）測試患者抑郁情況，6 例中重度抑郁患者；治療時間1～3 個月。試驗組男20 歲，女18歲，年齡在44～66 歲，平均年齡（55.11±0.01）歲；Zung 抑郁自評量表（SDS）測試7 例中重度抑郁；治療時間1～3 個月。兩組患者臨床資料在年齡、抑郁情況、基本家庭背景（中等收入，月人均工資3 000～4 000 元）、治療時間（1～3 個月）上差異不明顯，無統計學對比意義（P＞0.05）。

1.2 方法

臨床實驗和對比兩組細胞凋亡有效率、Bcl-2、Bax 和Survivin蛋白表達結果及其PXR 受體調控的CYP3A 誘導作用結果。流式細胞儀分析細胞周期及凋亡率。具體步驟為：收集細胞[數目約（1～ 5）×106個/mL]，500～ 1 000 r/min 離心5 min，棄去培養液；細胞洗滌，3 mL PBS 洗滌1 次；乙醇固定；離心去PBS，加入冰預冷的70% 的乙醇固定，4℃，1～2 h；細胞重懸，離心棄去固定液，3 mL PBS 重懸5 min；細胞過濾400 目的篩網過濾1次，500～1 000 r/min 離心5 min，棄去PBS；染色；用1 mL PI 染液染色，4℃避光30 min；流式細胞儀檢測；PI 用氬離子激發熒光，激光光波波長為488 nm，發射光波波長大于630 nm，產生紅色熒光分析PI 熒光強度的直方圖也可分析前散射光對側散射光的散點圖；結果判斷。免疫化學法檢測Bcl-2、Bax 和Survivin 蛋白。石蠟切片脫蠟至水；3%H202室溫孵育5 ～10 分鐘，以消除內源性過氧化物酶的活性；蒸餾水沖洗，PBS 浸泡5 min，（如需采用抗原修復，可在此步后進行）；5%～10%正常山羊血清（PBS 稀釋）封閉，室溫孵育10 min。傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1 ～2 h 或4℃過夜；PBS沖洗，5 min×3 次；滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗（1%BSA － PBS 稀釋），37℃孵育10 ～30 min；或滴加第二代生物素標記二抗工作液，37℃或室溫孵育10 ～30 min；PBS 沖洗，5 min×3 次；滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37℃孵育10 ～30 min；或第二代辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10 ～30 min；PBS 沖洗，5 min×3次；顯色劑顯色（DAB 或AEC）；自來水充分沖洗，復染，封片。考察THP 對Bcl-2 表達/ 癌細胞凋亡的影響和Survivin 表達/ 癌細胞凋亡的影響；考察THP 對PXR 受體調控的CYP3A誘導作用，可半定量地評價THP 對肝臟降解致癌物及其他效應物功能的誘導作用。

1.3 觀察指標[3]

細胞培養及倒置顯微鏡形態學觀察；AO 染色及熒光顯微鏡形態學觀察；MTT 法檢測THP 對腫瘤細胞增殖抑制作用。細胞凋亡：染色后細胞核呈棕褐色的細胞被判為凋亡細胞；凋亡細胞染色質濃聚，通常沿核膜分布；整體細胞形態發生變化，如細胞表面微絨毛狀突起消失，細胞間接觸消失，細胞質濃聚，形成具有膜結構的包裹著胞漿內容物和核物質的凋亡小體；相比壞死，凋亡細胞的核結構直到晚期才會解體。

1.4 統計學方法

應用統計學軟件包IBM SPSS Statistics 24.0（社會科學統計軟件包）對研究數據進行統計分析，計數資料均用χ2檢驗，以%表示，其他計量資料比較均以（±s）表示，以t檢驗，當P＜0.05時，具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組細胞凋亡結果

流式細胞術檢測細胞周期表明,隨GPS 濃度逐漸增高，S 期阻滯作用也逐漸增強,出現明顯的“亞二倍體”凋亡峰,隨濃度的增高凋亡峰也逐漸升高；TUNEL 染色法和掃描電鏡觀察到，GPS 使人肝癌細胞BEL-7402 發生明顯的凋亡形態變化,并隨濃度的增加出現凋亡作用逐漸增強；Western blot 結果顯示，隨GPS 濃度逐漸增高,凋亡相關蛋白Bax 的表達逐漸升高,抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達逐漸下降,同時出現死亡受體TNFR1 的表達增強,提高ERK 磷酸化水平。

2.2 兩組免疫化學法檢測結果

試驗組在Bcl-2、Bax 和Survivin 蛋白上優于對照組，有統計學意義（P＜0.05）。具體參見表格1 所示。

2.3 兩組PXR 受體調控的CYP3A 誘導作用結果

PXR 受體調控的CYP3A 誘導作用結果表明，CYP3A mRNA的基礎轉錄水平中CYP3A6、CYP3A4、CYP3A7 均無顯著增加。具體參見表格2 所示。

表1 兩組免疫化學法檢測結果比較（%）

表2 兩組PXR 受體調控的CYP3A 誘導作用結果比較

3 討論

人肝癌細胞凋亡誘導的研究中，通過分析腫瘤發生發展中細胞增殖、生長、分化、代謝等調節失控；細胞凋亡用以清除多余、衰老和受損傷的細胞來保持機體內平衡。三葉青多糖的應用，在肝癌細胞凋亡中，充當一系列基因激活、蛋白表達調控、預防和治療惡性腫瘤的效果確切。

汪正飛等[4]的研究表明，TFIC50 為3.247 mg/mL,TF 的高、中、低的劑量分別為5、1.25、0.312 5 mg/mL；TF 高、中、低濃度劑量48 h 后對肝癌HepG2 細胞增殖隨濃度的增加而逐漸增強；TF的高、中、低劑量的抑瘤率分別為64.07%、53.64%、46.69%；抑制腫瘤生長的抑制作用優于CTX（環磷酰胺）組。李振濤等證實，三葉青具有抑制腫瘤、保肝、抗炎及調節機體免疫等多種藥理活性,對抑制肝癌等多種消化系腫瘤細胞的增殖并促進其凋亡,而對正常細胞無明顯毒副作用,其抗瘤機制包括激活胱天蛋白酶（Caspase）家族啟動凋亡、引起B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）基因家族表達變化從而促進細胞色素C 的釋放等[5]。有研究認為[6]，有利于提取物中絕大多數活性成分的釋放，可以對健康人群和癌癥患者提供預防和輔助治療腫瘤以及提高抗氧化活性和免疫力等功效，尤其對癌癥患者的輔助治療和康復大有益處，可消除放療、化療的毒副作用，增加免疫力，且同樣適用于普通人預防腫瘤和提高機體抗氧化活性。高藥物能抑制SMMC-7721 肝癌細胞的生長,并具有濃度依賴性，光學顯微鏡、熒光顯微鏡下觀察,發現細胞凋亡現象；DNA 瓊脂糖凝膠電泳可見DNA 梯形條帶；流式細胞儀（Flow cytometry，FCM）檢測分析出現凋亡亞二倍體峰[7]。綜合來講，介入治療配合三葉青多糖的效果，旨在通過影響HepG2 通路，干預Bcl-2、Bax 和Survivin 蛋白表達，發揮其抑制細胞黏附基質、遷移和侵襲的作用[8-12]。

綜上所述，三葉青多糖對人肝癌細胞凋亡誘導作用明顯，且整體上加速了細胞凋亡率，改善了Bcl-2、Bax 和Survivin 蛋白表達，并無基因轉錄影響，值得臨床實踐中大力實施推廣。