斯里蘭卡土壤和沉積物中草甘膦及降解產物的分析及污染特征

田天琪，萬祎,*，魏源送，胡建英

1. 北京大學城市與環境學院，北京 100871 2. 中國科學院生態環境研究中心，北京100085

20世紀90年代中期，不明原因慢性腎病(CKDu)在斯里蘭卡北部省份首次被發現，至今CKDu已成為該國干旱地區最重要的公共衛生問題。據估計，斯里蘭卡的CKDu患病人數高達15萬[1]，其病理學特點為腎小管間質性腎炎伴單核細胞浸潤、腎小球硬化和腎小管性萎縮[2]。全球范圍內對CKDu病因的研究表明，該病可能是由多種因素的協同作用導致，這些因素包括化肥農藥接觸、有毒重金屬、氟化物及高硬度水質等[3]。

由于CKDu在當地稻農中高發，所以農藥(特別是草甘膦)接觸被認為是潛在的病因之一。世界衛生組織的研究表明，31.6%的CKDu患者體內的農藥殘留高于參考水平(2 μg·L-1)。其中，草甘膦(PMG)和氨基甲基膦酸(AMPA)在人群(n=57)血清及尿液中的檢出率分別為65%和28%[4]。草甘膦是世界上使用最廣泛的除草劑，在環境中主要通過微生物降解為氨基甲基膦酸，AMPA與PMG化學結構類似，在環境行為和毒性上也顯示出相似的特性[5]。PMG及AMPA結構式如圖1所示。雖然，美國環境保護局等認為接觸草甘膦對哺乳動物的危害極低[6]，但近期研究表明，PMG在低劑量下可導致肝腎損傷[5,7-8]。Mesnage等[9]在對大鼠進行的長達2年的低劑量PMG暴露實驗中發現，大鼠出現DNA損傷及腎臟纖維化現象。Gao等[10]使用PMG染毒小鼠后發現，其近端腎小管上皮細胞凋亡，并產生氧化應激反應。同時，也有報道表明，服用PMG制劑的病人出現急性腎損傷癥狀[11]。雖然，PMG本身在環境中半衰期較短(土壤中其半衰期為2～197 d，水中半衰期為2～91 d[12])，但因PMG結構中含有磷酸、羧基和氨基基團，屬于兩性物質(pKa1=2.6，pKa2=5.6，pKa3=10.6)，在中性和堿性條件下膦酸基團可與金屬離子配位，形成穩定且不溶于水的絡合物[8]，絡合物的半衰期可達數年之久[13]。特別在斯里蘭卡中北部發病區，地表及地下水硬度較高，部分地區水中Ca2+濃度高達250 mg·L-1[12]。鈣鎂等離子可與PMG形成穩定的絡合物，直接導致PMG在施用過程中部分失效，這會增加PMG使用量，并可能影響其在人體中的存在形態及其健康效應。為更好地評估PMG的環境風險及其與CKDu的相關性，有必要深入解析其絡合形態并優化分析方法，同時調查其在斯里蘭卡地區的污染特征。

圖1 草甘膦(PMG)(a)及其降解產物氨基甲基膦酸(AMPA)(b)的結構式Fig. 1 Structures of glyphosate (PMG) (a) and its degradation product aminomethyl phosphonic acid (AMPA) (b)

目前，關于水生環境中的PMG和AMPA，國內外已有較多研究，但對于田間土壤中這2種物質的研究卻很少[14]，土壤/沉積物樣品中PMG和AMPA的分析通常使用堿性溶液(如KOH、NaOH、NH4OH、Na2B4O7·10H2O和NH4OH/KH2PO4等)進行提取[15-16]，也有一些研究使用酸性提取液(如H3PO4[17-18]和KH2PO4[19]等)。尚沒有研究解析不同pH提取液在PMG提取分析上的差異。考慮到斯里蘭卡CKDu病區水質較硬、土壤中金屬離子含量較高，不同pH提取條件下PMG的絡合形態不同，會影響該物質的提取分析，故對比分析不同方法的優劣十分必要。另外，由于PMG與AMPA具有弱酸性、高極性和水溶性等特性且缺乏顯色和熒光基團，利用色譜質譜聯用儀進行分析時需要衍生化前處理。液相色譜質譜分析通常采用氯甲酸-9-芴基甲酯(FOMC-Cl)作為衍生試劑[20-21]，而氣相色譜質譜分析的常用衍生試劑為三氟乙酸酐(TFAA)與四苯基乙烯(TFE)或七氟丁醇(HFB)的混合試劑[22-24]。Freuze等[25]利用FMOC-Cl衍生結合液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)測定高鹽地下水樣品時，發現測定結果假陰性嚴重，原因為PMG在水樣中形成了草甘膦-金屬絡合物，在衍生過程中穩定存在不發生反應，極大影響了PMG的檢測準確率。

本研究將系統探究提取液pH、金屬離子和衍生試劑對土壤/沉積物中PMG檢測的影響，以草甘膦-鈣絡合物為例解析PMG的絡合效應及在分析過程中的影響，并測定了斯里蘭卡當地井水中的鈣離子濃度。進一步優化了土壤/沉積物中PMG及AMPA的氣相色譜-質譜(GC-MS)檢測方法，并應用于斯里蘭卡CKDu高發區的土壤和沉積物樣品檢測，為當地腎病的環境因子解析提供調查數據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑與儀器 (Reagents and instruments)

草甘膦(glyphosate)(純度>98.0%)、氨基甲基膦酸(aminomethyl phosphonic acid)(純度>98.0%)購自Dr. Ehrenstorfer公司(Augsburg，德國)；[1,2-13C215N]草甘磷標準品([1,2-13C215N]-glyphosate)(純度>99.0%)、三氟乙酸酐(trifluoroacetic anhydride)(純度>99.0%)、2,2,3,3,4,4,4-七氟-1-丁醇(2,2,3,3,4,4,4-heptafluoro-1-butanol)(純度>98.0%)和檸檬醛(citral)(純度>96.0%)均購自Sigma-Aldrich公司(Merck KGaA, Darmstadt，德國)；乙酸乙酯(HPLC級)、甲醇(HPLC級)均購自Fisher公司(New Jersey，美國)；磷酸(優級純)、鹽酸(優級純)購自北京市通廣精細化工公司；磷酸二氫鉀(優級純)、磷酸氫二鉀(優級純)和氫氧化鈉(優級純)均購自西隴化工股份有限公司；實驗中溶劑用水均為超純水(電導率18.2 MΩ·cm)，Poly-Pre CAX小柱(AG 50W-X8樹脂)購自上海安譜實驗科技股份有限公司。

分別稱取5 mg PMG和AMPA于聚乙烯塑料瓶中，加水定容至50 mL，后加入一滴鹽酸酸化，配制成100 μg·mL-1的儲備液。等分合并后，配制成含2種物質的1 μg·mL-1儲備液。于0～4 ℃保存，使用前加水稀釋為25、50、250和500 μg·L-1的系列標準溶液，于4 h內衍生化。

GCMS-QP 2010 ultra氣相色譜質譜聯用儀(Shimadzu, Kyoto，日本)；電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS，Thermo ICP-Q，美國)；微波消解儀(CEM Mars-6，美國)；Milli-Q超純水機(Millipore, Bedford，美國)；高速冷凍離心機(SIGMA 3-18K，SIGMA，德國)；真空冷凍干燥機(DRC-1000程序凍干倉，EYELA，日本)；數控超聲波清洗器(KQ-500DE，昆山市超聲儀器有限公司，中國)。

1.2 土壤、沉積物及水樣采集

土壤及沉積物樣品于2018年8月—10月采集于斯里蘭卡當地農田和水庫。土壤樣品采集于當地稻田，每塊稻田中采樣面積為30 cm×30 cm，使用五點采樣法從深度約10 cm處采集5個表層土樣品，并充分混合。從地表水底采集沉積物樣品，土壤及沉積物樣品用鋁箔及自封袋密封，儲存于-20 ℃冰箱中。水樣采集于稻田附近的水井，從井中取約50 mL水樣保存于聚乙烯瓶中，于4 ℃冰箱中保存。樣品采集點如圖2所示。

圖2 沉積物和土壤樣品采集點(a)及不同不明原因腎病(CKDu)發病區稻田照片(b)注：1、2、4和5處同時采集了井水樣品。Fig. 2 Sampling sites of sediment and soil samples (a), and pictures of paddy field in areas with different chronic kidney disease of unknown etiology (CKDu) incidences (b)Note: Well water samples were also collected at sites 1, 2, 4 and 5.

1.3 草甘膦前處理方法比較

4種方法對應的提取液分別為A[26](0.25 mol·L-1NH4OH+0.1 mol·L-1KH2PO4，pH≈10)，B[16](0.6 mol·L-1KOH，pH≈14)，C[12](0.1 mol·L-1磷酸鉀緩沖溶液，pH≈7)；D[14](10% H3PO4，pH≈1)。所有土壤及沉積物樣品約取50 g凍干，隨后進行研磨并過100目篩，儲存于廣口瓶中。處理時取0.5 g樣品于10 mL離心管中加入0.5 mg·L-1同位素標記的內標溶液100 μL([1,2-13C215N]-glyphosate)。然后，分別加入4種提取液A(2 mL)、B(2 mL)、C(5 mL)和D(1 mL)。A/B/D組震蕩90 min，C組水浴超聲3次，每次10 min。隨后4組均離心10 min(3 500 r·min-1)，收集上清液。D組再次加入1 mL提取液重復上述操作并合并上清液。取各組提取液1 mL直接進行后續凈化與衍生分析。為了比較酸化對于不同提取方法的影響，再各取1 mL提取液加入酸性調節液(16 g磷酸二氫鉀+160 mL水+13.4 mL鹽酸+40 mL甲醇)調節至pH=1后再進行凈化與衍生檢測。

Poly-Pre CAX交換柱經10 mL水活化后，加入上述提取液，隨后用1 mL CAX洗脫液(160 mL水+2.7 mL鹽酸+40 mL甲醇)淋洗2次，再用13 mL CAX洗脫液進行洗脫并收集洗脫溶液。所得溶液于真空凍干機凍干后加入CAX洗脫液定容至1 mL待衍生，樣品于-20 ℃保存。

1.4 衍生前處理和GC-MS分析

采用《植物性產品中草甘膦殘留量的測定 氣相色譜-質譜法》(GB/T 23750—2009)[27]中的衍生及檢測方法。衍生試劑為三氟乙酸酐(TFAA)/七氟丁醇(HFB)溶劑(VTFAA/VHFB=2∶1)，臨用前配制，并保存于-80 ℃。取1.6 mL衍生試劑于4 mL樣品瓶中，加蓋后放入-40 ℃的低溫冰箱中冰凍0.5 h后取出。用移液槍在衍生劑液面下緩慢加入50 μL提取液(同時進行混合標準工作溶液及質量控制樣品衍生)。加蓋后混勻，于90 ℃烘箱中衍生1 h(每15 min振搖一次)。取出后冷卻至室溫，氮吹至干，加入200 μL 0.2%檸檬醛-乙酸乙酯溶液(100 mL乙酸乙酯+200 μL檸檬醛，避光保存，有效期1個月)，渦旋混勻，待進樣。

色譜柱為HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細管色譜柱，進樣口溫度200 ℃；升溫程序為80 ℃保持1.5 min，以30 ℃·min-1升至260 ℃，保持1 min，再以30 ℃·min-1升至300 ℃；不分流進樣，進樣體積1 μL；載氣為氦氣(純度≥99.999%)，流速1.0 mL·min-1；EI離子源(70 eV)，離子源溫度250 ℃；接口溫度270 ℃；選擇離子監測方式(SIM)，PMG衍生物的定性離子為612、584、460，定量離子為611；AMPA衍生物的定性離子為372、502，定量離子為446。PMG同位素標記內標定性離子為615、586，定量離子為614。

1.5 草甘膦-鈣絡合物制備

采用Subramaniam和Hoggard[28]的方法制備草甘膦-鈣絡合物。稱取草甘膦8.45 mg溶于125 μL含有4 mg NaOH的溶液中，渦旋使其全部溶解后與125 μL含有5.5 mg CaCl2的溶液混合，室溫下靜置24 h。將得到的白色晶體濾出，使用超純水清洗，干燥。分別稱取5 mg絡合物，依次加入到0.5 mL pH為1、3、5、7、9、11和13的水溶液中(使用HCl與NaOH配制)并充分震蕩混合均勻，觀察記錄絡合物溶解情況。各取上清液50 μL進行上述衍生檢測。隨后濾出沉淀并用超純水沖洗，干燥后稱重。并重新溶于0.5 mL pH=1的水溶液中，充分震蕩混合均勻，取50 μL上清液進行衍生檢測。

1.6 水樣鈣離子和草甘膦分析

取10 mL水樣，加入1%硝酸酸化。使用1%硝酸溶液配制濃度為0.05～30 mg·L-1的鈣離子標準溶液，待ICP-MS檢測。水樣經過酸化后，直接經過Poly-Pre CAX交換柱，并最終采用衍生處理-GC-MS方法分析，具體凈化、衍生和儀器分析步驟與土樣分析相同。

1.7 質量保證與質量控制(QA/QC)

所有玻璃儀器均使用甲醇清洗，避免樣品污染。加標實驗中，土壤及沉積物樣品加入PMG、AMPA的濃度為2 mg·kg-1，為優化不同的前處理方法，每種方法進行3組平行實驗。每3個樣品后加入一個過程空白樣品。儀器分析表明，PMG與AMPA在2～100 ng·mL-1范圍內線性良好(r2>0.999)，檢出限為20 μg·kg-1。水樣中鈣離子在0.05～30 mg·L-1范圍內線性良好(r2>0.999)。

2 結果與分析(Results and discussion)

2.1 草甘膦與鈣離子的絡合特征

PMG可與多種金屬形成不溶于水的絡合物，干擾其提取與分析。特別在斯里蘭卡CKDu高發區，水質硬度較高[13]，故本實驗研究了PMG與鈣離子的絡合效應。PMG可與鈣以1∶1比例形成不溶于水的絡合物，其結構式為Ca(Hgly)·2.25H2O[29]。采用上文方法制得絡合物后，取5 mg絡合物溶于不同pH溶液中(其中含PMG約3.36 mg)。一方面測定上清液中PMG含量，另一方面將不溶的絡合物濾出，并測定其中PMG含量。上清液與不溶絡合物中PMG的質量隨pH的變化規律如圖3所示。由圖3可知，草甘膦-鈣絡合物在中性條件下溶解度最低，隨酸性或堿性的增強，溶解度逐漸升高，在pH=1或pH=13時完全溶解。

圖3 不同pH值的水溶液中草甘膦與鈣絡合物的形態分布(a)與實際樣品溶解情況(b)Fig. 3 Morphologies (a) and the dissolution of actual samples (b) of glyphosate-calcium complexes in water solution at different pH values

值得注意的是，在酸性及中性條件下，PMG在不溶絡合物和上清液中的總檢出量與總投入量(3.36 mg)相符。草甘膦-鈣絡合物沉淀通過文獻方法制備而成，目前還沒有該絡合物的直接分析方法，采用的TFAA-HFB衍生分析方法只能分析游離態PMG。因此，基于溶液中PMG的質量平衡分析，可以判斷酸性及中性條件下，PMG以游離態形式溶于溶液中。但是，在堿性條件下，上清液和沉淀中的PMG總檢出量明顯低于總投入量。特別在pH=13時，溶液中無沉淀物存在，但總檢出量為1.77 mg，加入濃鹽酸酸化后，所加入的PMG可被完全檢出。這說明，在堿性條件下(pH=13)草甘膦-鈣絡合物能夠完全溶解，但是大約只有53%的PMG以游離形式存在，其他的PMG可能與鈣以絡合物形式存在，但是現有的分析方法無法直接證明這部分PMG的具體存在形式。

2.2 斯里蘭卡土壤/沉積物樣品草甘膦分析的前處理方法優化

為了驗證不同前提取方法對斯里蘭卡土樣中草甘膦的提取效率，使用4種不同pH值的提取液對當地采集的土樣進行加標回收實驗。土樣加標穩定后(PMG和AMPA加標濃度均為2 mg·kg-1)，使用不同的提取液提取，A/B提取液為堿性(pH=10～14)，C提取液為中性(pH≈7)，D提取液為酸性(pH≈1)，提取液經過凈化和衍生處理-GC-MS分析，對象物質的回收率能反映該方法的可靠性。提取后的溶液分為直接衍生與酸化后衍生2組，探究pH值對提取及衍生過程的影響，結果如表1所示。

表1 4種提取方法及酸化前后加標回收率Table 1 Recoveries of four extraction method with or without acidification before derivatization

若對4種提取液進行直接衍生，A、B和C這3組的回收率均較低，為60%左右。D組的回收率最高(84.5%)。相比之下，將提取液酸化后再進行衍生，4種方法的回收率分別為73.8%、83.7%、87.2%和90.1%。這表明，PMG在不同pH提取液中的存在形式不同，隨溶液堿性的增加，部分PMG以絡合形式存在，酸化解離后才可被衍生及檢測。而在衍生前酸化的前提下，酸、中和堿性提取液均能較好地提取出土壤中的PMG和AMPA。結合上述絡合形態分析實驗可知，中性環境最不利于絡合物的溶解，但pH=7時所得到的草甘膦-鈣絡合物的飽和溶液中PMG的濃度為180 mg·L-1，遠大于添加的PMG濃度(0.2 mg·L-1)。因此，提取液pH雖然會影響PMG的存在形式，但不影響對環境濃度下PMG和AMPA的提取。上述結果說明，酸化步驟對于PMG衍生反應的重要性。

根據上述土樣的回收率實驗結果，選擇B、C和D提取液對更多的當地土壤及沉積物樣品進行方法篩選的實驗。筆者發現使用酸性溶液對斯里蘭卡土壤提取后，所得的提取液雜質含量過多，后續凈化困難，而C、D提取液能夠更有效地測定出當地土壤和沉積物中的PMG和AMPA。實驗結果表明，PMG實際環境濃度約為0.1 mg·kg-1。因此，針對環境濃度，進一步開展了針對當地土壤的低濃度(0.3 mg·kg-1)加標回收實驗，發現C提取液組PMG回收率為83.4%±3.7%，AMPA回收率為87.1%±4.8%，而D溶液組獲得的回收率顯著降低，PMG的回收率為65.8%±11.2%，AMPA的回收率為78.3%±9.3%。根據上述結果可知，C提取液經過固相萃取凈化后直接衍生分析，能夠高效回收土樣中的對象物質，準確測定其物質濃度，因此，最終采用C提取液進行斯里蘭卡環境樣品的分析。該方法提取、凈化和衍生處理-GC-MS分析獲得色譜圖如圖4所示，內標PMG在實際土壤中被有效回收，并且PMG和AMPA具有明顯檢測峰，無雜質干擾。

圖4 草甘膦及其降解產物的標樣(a)及樣品檢出(b)色譜圖注：*表示同位素內標。Fig. 4 Gas chromatograms of PMG and its degradation product AMPA in standards (a) and samples (b)Note: *represents the isotope internal standard.

2.3 草甘膦在斯里蘭卡的環境濃度及分布特征

利用上述方法對斯里蘭卡由南至北采集的土壤和沉積物樣品進行廣泛分析，檢出的PMG和AMPA的濃度如表2所示。該國的土壤樣品中廣泛檢出了PMG和AMPA，而沉積物樣品中PMG的含量相對較低，且無AMPA檢出。這可能是因為金屬與草甘膦形成絡合物導致土壤對其的吸附能力較強，增加了PMG的持久性。而沉積物含水量較高且微生物較多，可更多地溶解PMG及AMPA并加速其降解。同時，對采集的當地水樣也進行了分析，發現PMG及AMPA在水樣中都未檢出，這與該類農藥在水中易于降解的機制相符，需要分析土壤和沉積物樣品來調查該類物質的污染程度。

表2 土壤樣品(SO)與沉積物樣品(SE)中的PMG和AMPA濃度Table 2 Concentrations of PMG and AMPA in soil (SO) and sediment (SE) samples

本研究中的土壤樣品采自如圖2(b)所示5個稻田中。斯里蘭卡由南至北不同地區的水稻種植情況不同。采樣期間，中北部CKDu高發區稻田(4和5)并不在耕種期內，而同時期非CKDu病區的南部稻田處于耕種期。在這種情況下，北部稻田土壤中PMG和AMPA含量(最高可達328 μg·kg-1)還要高于南部地區。對由南至北的水樣中的鈣離子進行了分析，其中，南部城市康提附近水樣中鈣離子濃度為11.4～31.2 mg·L-1，而北部阿努拉德普勒地區水樣中鈣離子濃度高達677～778 mg·L-1。可以看出，中北部地區井水硬度遠高于南部地區，屬于高硬水，因此，在施用過程中草甘膦易于與水中的鈣離子絡合，需要加大使用量才能獲得同樣的藥效。也有其他研究檢測了CKDu病區土壤中PMG的濃度(n=9)，范圍為270～690 μg·kg-1，AMPA濃度為2～8 μg·kg-1[2]，這與本研究PMG的檢出水平相當。對比其他國家的土壤調查，丹麥農田土壤中PMG和AMPA的平均水平分別為0.8 μg·kg-1和10.4 μg·kg-1[30]，阿根廷農田土壤中PMG和AMPA的平均水平分別為35～1 502 μg·kg-1和299～2 256 μg·kg-1[31]。而這些結果與本研究的結果相似，降解產物AMPA的濃度要高于PMG本體。綜上，斯里蘭卡北部CKDu疾病高發區可能由于水質硬度高，導致當地稻田農民使用更大量的草甘膦，造成農民的高濃度PMG暴露，可能是CKDu疾病高發的因素之一。

本研究解析了草甘膦-鈣絡合物在不同pH條件下的溶解情況及存在形態，并在此基礎上對土壤/沉積物樣品中草甘膦類物質的分析方法進行了優化，建立了適合斯里蘭卡地區土壤中PMG及AMPA的提取和衍生處理-GC-MS分析方法。將此法應用于該地區土壤和沉積物中草甘膦類物質的調查，發現該國稻田土壤樣品中能廣泛檢出PMG和AMPA。其中，中北部CKDu高發區稻田雖然并未處于耕種季，但土壤中PMG和AMPA的濃度要高于南部土壤，這可能是因為北部稻田附近井水的硬度遠高于南部井水，草甘膦與硬水中鈣離子的絡合作用導致北部稻田草甘膦的施用量顯著增加，從而可能導致當地稻農的PMG高暴露，推測此為該地CKDu疾病高發的潛在環境因素之一。

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