響應(yīng)面法優(yōu)化低溫水提薏苡仁糖蛋白的制備及理化特性的研究*

鄭文宇，林維杰，楊容，楊土娣，李靜，廖蘭,

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 300134；2.福州大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350102）

薏苡仁具有抗腫瘤、提高機(jī)體免疫、抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、降血糖和調(diào)血脂等藥理活性作用[1]。李時珍在《本草綱目》稱其為上品養(yǎng)心藥。薏苡仁含淀粉60%～65%、多糖5.28%、蛋白質(zhì)18.31%、脂肪5.61%[2]，還含豐富的B族維生素和磷、鐵、鈣、鋅、鉀等多種礦物質(zhì)。薏苡仁結(jié)構(gòu)緊密，淀粉含量高，水溶性較差，生物活性物質(zhì)提取率較低且易產(chǎn)生回生、老化和沉淀的現(xiàn)象，導(dǎo)致其難以消化，一定程度限制了其開發(fā)利用。

目前，國內(nèi)外學(xué)者已就薏苡仁酯、多糖、脂類等的化學(xué)成分和功能作用進(jìn)行了深入研究[3]，但對其蛋白類活性物質(zhì)的研究有限，特別是其糖蛋白組分的研究缺乏。張怡等[4]通過石油醚脫脂和水提乙醇、丙酮、乙醚沉法制備糖蛋白粗品，杜曉旭[5]通過熱水浸提和Sevag法制備薏苡仁糖蛋白粗品。由于缺乏高純度樣品，目前薏苡仁糖蛋白的研究局限于提升薏苡仁糖蛋白得率的手段、分離純化方式等方面，缺乏深入薏苡仁糖蛋白高純度活性構(gòu)效關(guān)系的研究。本文以響應(yīng)面法優(yōu)化低溫水提法的制備較高純度的薏苡仁糖蛋白，并對其理化特性進(jìn)行研究，為后續(xù)O-糖鏈釋放前后對于薏苡仁糖蛋白活性構(gòu)效關(guān)系的研究提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

薏苡仁，白殼種，購自福建南平浦城集貿(mào)市場；

三氯甲烷、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、菲咯嗪，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

電子天平（ML204）：梅特勒-托利儀器有限公司；

高速組織勻漿機(jī)（PT 2100）：寶創(chuàng)科技股份有限公司；

高速冷凍離心機(jī)（TGL-20MB）：長沙湘智離心機(jī)有限公司；

高速分散均質(zhì)機(jī)（FM200）：廈門精藝業(yè)主科技有限公司；

實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（EL20 ）：梅特勒-托利多儀器有限公司；

傅里葉紅外光譜儀（Nicolet）：美國尼高力儀器公司 ；

酶標(biāo)儀（Spark-10M）：帝肯上海貿(mào)易有限公司；

冷凍干燥機(jī)（FD-1C-50）：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 預(yù)處理

將薏苡仁打粉過80目篩，配制成20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）懸浮液，30 ℃恒溫水化12 h。高壓均質(zhì)20 MPa、3次，冷凍干燥制樣，密封陰涼干燥處儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 薏苡仁糖蛋白提取精制工藝流程

薏苡仁凍干粉→水提法（控制料液比、時間、溫度）→離心→過濾→蒸發(fā)濃縮→Sevag法脫除游離蛋白質(zhì)→無水乙醇沉淀→溶解、透析→真空冷凍干燥→薏苡仁糖蛋白精制品（CSGP）

⑴ Sevage法脫除游離蛋白：薏苡仁糖蛋白濃縮液加入Sevage試劑（氯仿∶正丁醇=3∶1[體積分?jǐn)?shù)]），其中薏苡仁糖蛋白濃縮液與Sevage試劑比例為4∶1（體積分?jǐn)?shù)），磁力攪拌40 min，脫除游離蛋白質(zhì)，離心取上清液，重復(fù)上述操作4～5次。

⑵ 醇沉：取上清液以1∶4（體積分?jǐn)?shù)）的比例加入95%乙醇，磁力攪拌35 min，密封包裝置于4 ℃冰箱中放置12 h，10,000 r/min離心30 min，收集沉淀為薏苡仁糖蛋白粗品。

⑶ 透析：將薏苡仁糖蛋白粗品溶于水中，裝入截留分子量為8,000～14,000 Da的透析袋內(nèi)，流動的自來水透析處理48 h，收集透析袋內(nèi)的液體，冷凍干燥得薏苡仁糖蛋白精制品（CSGP）。

1.2.3 薏苡仁糖蛋白含量的測定

采用王應(yīng)強(qiáng)[6]的苯酚-硫酸法方法稍作修改，具體方法如下：

⑴ 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液配制：準(zhǔn)確稱取10 mg的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，加水定容至100 mL，配制成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。

⑵ 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：準(zhǔn)備6支帶塞試管，移入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。加入水補(bǔ)足至1.0 mL，移取1.0 mL苯酚溶液，立即移入濃硫酸5.0 mL。靜置20 min，使苯酚和硫酸充分反應(yīng)，振蕩均勻，混合。放置于30 ℃的水浴中，恒溫反應(yīng)20 min。建立對照，確定490 nm處吸光度，平行測定3次，取平均值。以葡萄糖濃度和吸光度為水平坐標(biāo)和垂直坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性回歸方程。

⑷ 換算因子f的確定：根據(jù)陳雙[7]的方法稍作修改，準(zhǔn)確稱量薏苡仁糖蛋白粗品10 mg，用蒸餾水定容至100 mL，配制成0.1 mg/mL的溶液，搖勻后靜置存放。準(zhǔn)確吸取1 mL 0.1 g/L的薏苡仁糖蛋白粗品溶液，按本章2.3.2.1的處理步驟進(jìn)行操作，測出吸光值A(chǔ)，代入回歸方程A=12.9C+0.0037，R2=0.9996中，計(jì)算出薏苡仁糖蛋白粗品中葡萄糖的濃度和理論薏苡仁糖蛋白質(zhì)量M（mg），重復(fù)3次操作，測定3次結(jié)果，取平均值記為M=0.05169 mg；記實(shí)際薏苡仁糖蛋白質(zhì)量m0（mg），換算因子計(jì)算結(jié)果為f=m0/M=1.93471；薏苡仁糖蛋白含量的計(jì)算公式為C=(A-0.0037)×n×f/12.9，其中A為樣品的吸光值，C為樣品濃度（mg/mL），n為稀釋倍數(shù)，f為換算因子。

1.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.1 料液比對薏苡仁糖蛋白得率的影響

取6個25 mL錐形瓶，稱量樣品0.5 g/個，將裝有配制好的樣品用保鮮膜塑封瓶口防止濺出，在恒溫水浴振蕩器中水化提取，按1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14，溫度35 ℃，反應(yīng)時間3 h，進(jìn)行不同料液比下的單因素實(shí)驗(yàn)，設(shè)置3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 溫度對酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響

取6個25 mL錐形瓶，稱取樣品0.5 g/個，將裝有配制好的樣品用保鮮膜塑封瓶口防止濺出，在恒溫水浴振蕩器中水化提取，按每小時取一次樣，溫度35 ℃，料液比1∶10，進(jìn)行不同提取時間的單因素實(shí)驗(yàn)，設(shè)置3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 提取溫度對薏苡仁糖蛋白得率的影響

取6個25 mL錐形瓶，稱取樣品0.5 g/個，將裝有配制好的樣品用保鮮膜塑封瓶口防止濺出，在恒溫水浴振蕩器中水化提取，按20～45 ℃每5 ℃，料液比1∶10，反應(yīng)時間3 h，進(jìn)行不同溫度下的單因素實(shí)驗(yàn)，設(shè)置3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理，以薏苡仁糖蛋白得率（Y）為響應(yīng)指標(biāo)，選取提取時間（A）、提取溫度（B）、料液比（C）為響應(yīng)因子，進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定抗氧化肽制備的最佳工藝條件。實(shí)驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表

1.5 薏苡仁糖蛋白（CSGP）O-糖鏈釋放產(chǎn)物（DCSGP）的制備

根據(jù)Zheng等[7]人的方法稍作修改，取1.0 mg CSGP溶解于10 mL 0.2 mol/L的NaOH溶液中，反應(yīng)在55 ℃進(jìn)行6 h，使O-糖鏈釋放（發(fā)生β-消除反應(yīng)），得到產(chǎn)物記為DCSGP。

1.6 薏苡仁糖蛋白O-糖鏈釋放前后的理化性質(zhì)測定

1.6.1 CSGP、DCSGP蛋白質(zhì)含量和糖含量測定

根據(jù)杜曉旭等[8]人的方法稍作修改：采用凱氏定氮法和苯酚-硫酸法。

1.6.2 CSGP、DCSGP定性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)李婷婷等[9]、Guo等[10]和Yun等[11]人的方法稍作修改，對顏色、狀態(tài)、溶解性、雙縮脲反應(yīng)、280 nm處吸收、CTAB絡(luò)合反應(yīng)、I2-KI反應(yīng)、斐林試劑反應(yīng)、FeCl3反應(yīng)、硫酸-咔唑反應(yīng)進(jìn)行測定。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，采用Excel 2007對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，Origin 9.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖，采用SPSS（p＜0.05）比較平均值之間的差異性并進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 料液比的確定

由圖1可以看出，隨著水用量的增加，薏苡仁糖蛋白得率先上升后下降，在料液比1∶10 g/mL時達(dá)到最大。當(dāng)料液比過低，水量少，溶液過飽和，薏苡仁糖蛋白溶解不充分；隨著用水量的增加，薏苡仁糖蛋白溶解度逐漸上升。當(dāng)料液比過大，能耗隨之加大，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)過程中的損失加大，使薏苡仁糖蛋白提取率下降。

2.2.2 提取溫度的確定

提取溫度對薏苡仁糖蛋白得率的影響如圖2所示。薏苡仁淀粉60 ℃會發(fā)生糊化，溶于水并與其他水溶性物質(zhì)同時溶出，因此，低溫提取對于提高薏苡仁糖蛋白得率是一個比較重要的因素。由圖2可以看出，隨著溫度的升高，薏苡仁糖蛋白得率先上升后下降，在25 ℃時達(dá)到最佳。這可能是溫度升高，伴隨淀粉形成糊精的發(fā)生，阻礙薏苡仁糖蛋白溶出，此外過高的提取溫度會導(dǎo)致多糖生物活性的喪失。

2.2.3 時間的確定

由圖3可知，隨著時間的增加，薏苡仁糖蛋白得率先上升后下降，在3 h時達(dá)到最佳。提取時間過短，薏苡仁糖蛋白提取不完全；隨著提取時間的不斷增加，薏苡仁糖蛋白提取率呈現(xiàn)下降趨勢，可能是蛋白質(zhì)顆粒之間作用增強(qiáng)，使蛋白質(zhì)易凝結(jié)而聚沉，引起糖蛋白結(jié)構(gòu)上的破壞和生物活性的失活。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

低溫水提薏苡仁糖蛋白的工藝優(yōu)化根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了17組實(shí)驗(yàn)，5組為中心點(diǎn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，如表2所示。本實(shí)驗(yàn)以糖蛋白提取率作為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對IC50值Y進(jìn)行多元回歸擬合。得到二次多項(xiàng)式擬合方程為：

回歸模型的顯著性檢驗(yàn)和方差分析見表3，由表3可知，回歸方程極顯著（p＜0.0001），失擬項(xiàng)不顯著（p=0.1098＞0.05），模型擬合程度好；相關(guān)系數(shù)R2=0.9981＞0.9，說明模型滿足了99%的樣本空間；模型中的參數(shù)A、B、C、AB、BC、A2、B2、C2都是顯著的（F＜p＜0.05），顯著參數(shù)超過三分之二；同時該模型的CV=1.29%，CV值低，置信度高，說明模型方程能準(zhǔn)確地反應(yīng)實(shí)驗(yàn)值，說明回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以通過該回歸方程確定低溫水提薏苡仁糖蛋白的最佳工藝條件。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸模型方差分析表

交互項(xiàng)AB、BC顯著，說明提取時間和提取溫度、提取溫度和料液比有顯著的交互作用。根據(jù)回歸方程做出三維曲面圖及等高線圖，如圖4、圖5所示。固定提取時間，薏苡仁糖蛋白提取率隨提取溫度的增加先急劇增加后略有下降；固定提取溫度，薏苡仁糖蛋白提取率隨提取時間增加先增大后減小。固定提取溫度，薏苡仁糖蛋白提取率隨料液比的增加先急劇增加后略有下降；固定料液比，薏苡仁糖蛋白提取率隨提取溫度的增加先增大后減小，并且交互作用十分明顯。這與前面的回歸方程結(jié)果相吻合。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由Design Expert結(jié)果分析可知，薏苡仁糖蛋白最佳提取方案：料液比1∶9.72，提取溫度25.31 ℃、提取時間3.09 h，在此條件下，重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次得薏苡仁糖蛋白提取率(6.87±0.31)%，與預(yù)測值6.91%相差不大，表明響應(yīng)面模型優(yōu)化具有可行性。

2.5 薏苡仁糖蛋白O-糖鏈釋放前后的理化性質(zhì)分析

由表4可以得到：CSGP和DCSGP均易溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑。雙縮脲反應(yīng)和280 nm處吸收均為陽性，說明CSGP和DCSGP均含有蛋白質(zhì)。與CTAB反應(yīng)呈陽性，與I2-KI反應(yīng)、斐林試劑反應(yīng)、FeCl3反應(yīng)、硫酸-咔唑反應(yīng)均呈陰性，說明CSGP為非淀粉類酸性糖蛋白，DCSGP為非淀粉類酸性糖和蛋白的混合物，均不含有還原糖、多酚、糖醛酸類物質(zhì)。

表4 CSGP、DCSGP理化性質(zhì)

3 結(jié)論

采用低溫水提醇沉的方法制備了薏苡仁糖蛋白，通過控制料液比、提取時間、提取溫度3個因素，以薏苡仁糖蛋白得率為指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，得到薏苡仁糖蛋白提取率最佳體系條件為：料液比為1∶9.72 g/mL、提取時間為3.09 h、提取溫度為25.31 ℃，此條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次得薏苡仁糖蛋白提取率為(6.87±0.31)%，薏苡仁糖蛋白是非淀粉類半結(jié)晶狀的酸性糖蛋白[糖含量(42.48±1.13)%、蛋白含量(27.15±1.30)%]，不含有還原糖、多酚、糖醛酸類物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)可以為進(jìn)一步研究薏苡仁糖蛋白結(jié)構(gòu)功能的關(guān)系和深度應(yīng)用開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。