TPCK-胰蛋白酶酶解縊蟶工藝條件優化

張惠婷

（福建省產品質量檢驗研究院，福建 福州 350002）

多肽是具有特定氨基酸序列的生物活性物質[1]，其消化吸收率及營養價值均優于蛋白質或氨基酸，且其所具有的生理功能氨基酸無法比擬[2]，因此其也被稱作為生物活性肽。生物活性肽的種類較多、分布較廣[3]、食用安全性極高[4]，它不但能夠提供機體生長發育所需的營養物質，還具有抗高血壓、調節免疫、抗細菌等多種功能[5]。將大分子的蛋白質酶解成小分子的多肽，不但能夠提高蛋白質的消化利用率，而且還能得到不同功能的生物活性肽。

目前，生物活性肽常用的制備方法為酶解法[6]。在選擇利用酶解法制備生物活性肽時，挑選富含蛋白質的原料進行酶解十分關鍵。縊蟶在福建又稱蟶子，其資源豐富[7]，分布廣泛，富含蛋白質[8]，在生物活性肽的研究方面具有極大的潛力。以資源豐富、富含蛋白質的縊蟶為原料制備生物活性肽，不但能夠充分地利用縊蟶蛋白，有效地發揮縊蟶存在的營養價值，還能夠充分利用縊蟶資源，具有極大的市場發展空間。

利用酶解法制備生物活性肽時，不同種類酶的選擇可以得到不同的多肽。TPCK-胰蛋白酶是一種特異性的肽鏈內切酶，能夠專一性地切割蛋白分子中精氨酸（Arg）、賴氨酸（Lys）位點[9]。采用具有專一性酶切位點的TPCK-胰蛋白酶對縊蟶蛋白進行酶解，可得到具有特定C末端殘基的肽段。在酶解過程中對酶解工藝條件的控制，很大程度上影響酶解的效果。因此，本試驗采用TPCK-胰蛋白酶對鮮縊蟶肉進行酶解，在單因素試驗基礎上，通過正交試驗優選TPCK-胰蛋白酶的酶解工藝條件，為今后進一步研究制備縊蟶多肽提供數據參考。

1 材料與設備

1.1 材料

鮮活縊蟶：購于福建福州永輝超市；

TPCK-胰蛋白酶：購于上海國源生物技術有限公司，酶活性為1.1萬U/mg（反應溫度：37 ℃）；

Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標準品：購于美國Sigma公司；

其他試劑均為分析純。

1.2 設備

PB-10型pH計：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；

TGL-16C臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；

BS 224S型電子分析天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；

T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

2 試驗方法

2.1 技術路線

鮮活縊蟶→去殼取鮮肉絞碎→酶解→滅酶→酶解液離心→取上清液→測定多肽含量

2.2 多肽提取量測定

凡具有兩個直接連接的肽鍵都有雙縮脲反應[10]。因此，本文酶解液中多肽提取量的測定方法參照文獻[11,12]中的雙縮脲測定法，并作適當修改。具體測定方法如下：

2.2.1 四肽（Gly-Gly-Tyr-Arg）標準曲線的制作

用5%（W/V）的三氯乙酸分別配制濃度梯度為0.0～1.0 mg/mL的四肽標準溶液，將不同濃度的四肽標準溶液與雙縮脲試劑按體積比3∶2加入試管中，搖勻靜置離心，取上清液測定OD值（540 nm）。

2.2.2 提取量測定

稱取去殼的鮮縊蟶肉進行酶解，經滅酶、冷卻后，將酶解產物全部轉移至100 mL容量瓶中，定容離心獲得上清液Ⅰ。取上清液Ⅰ與等體積的10%（W/V）三氯乙酸水溶液混合均勻，靜置離心獲得上清液Ⅱ。取上清液Ⅱ，用5%（W/V）的三氯乙酸水溶液定容于25 mL容量瓶中，獲得樣品溶液Ⅲ。將樣品溶液Ⅲ與雙縮脲試劑按體積比3∶2加入試管中，搖勻靜置離心，取上清液測定OD值（540 nm）。通過所得的四肽回歸方程，計算樣品溶液Ⅲ中多肽的質量濃度C（mg/mL）。以下為多肽提取量的計算公式：

式中：

M表示多肽提取量，即每克新鮮縊蟶肉酶解得到的多肽毫克數，mg/g；

C為樣品溶液Ⅲ中多肽的質量濃度，mg/mL；

V1為所吸取的上清液Ⅱ的體積，mL；

V2為樣品溶液Ⅲ的體積，mL；

m為所稱取新鮮縊蟶肉的質量，g；

2表示等體積的Ⅰ溶液與10%（W/V）的三氯乙酸水溶液混合后體積擴大的倍數。

2.3 TPCK-胰蛋白酶酶解工藝研究

2.3.1 TPCK-胰蛋白酶酶解工藝的單因素試驗

準確稱取一定質量新鮮的去殼縊蟶肉，以pH=7.8的緩沖溶液作為反應液，在水浴溫度37 ℃條件下進行反應，分別考察酶解時間1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h、料液比1∶1.0、1∶2.0、1∶3.0、1∶4.0、1∶5.0、1∶6.0和酶添加量4500、9000、13500、18000、22500 U/g對多肽提取量的影響。按2.2.2的方法測定多肽提取量。

2.3.2 正交試驗優選TPCK-胰蛋白酶的酶解工藝

在單因素試驗的基礎上，采用L9（34）正交試驗設計，優選TPCK-胰蛋白酶的酶解工藝，試驗因素及水平見表1。

表1 TPCK-胰蛋白酶酶解正交試驗因素及水平

3 結果與分析

3.1 四肽標準曲線的制作

按本文2.2.1方法，得四肽質量濃度（X）與其光密度（Y）之間的回歸方程為：Y=0.1443X+0.0017，R2=0.9998，變量X的范圍落在0～1 mg/mL之間。

3.2 TPCK-胰蛋白酶的酶解工藝研究及其優化

3.2.1 酶解時間對TPCK-胰蛋白酶酶解效果的影響

稱取5 g新鮮去殼縊蟶肉，用pH值為7.8的緩沖溶液作為反應液，酶添加量為2250 U/g，料液比為1∶3.0，酶解溫度為37℃條件下，分別酶解1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h，酶解結果如圖1所示。由圖1可知，酶解時間在1.0～5.0 h之間時，多肽提取量呈先上升后下降的變化趨勢。當酶解時間為2.0 h左右時，多肽提取量達到單因素試驗的最高水平。而當酶解時間大于5.0 h時，多肽提取量基本保持不變。這可能是由于TPCK-胰蛋白酶是一種特異性比較強的內切酶，隨酶解時間的延長，酶解液中已沒有適合TPCK-胰蛋白酶作用位點的肽段。因此多肽提取量最終趨于平衡不變的趨勢。綜上，酶解的時間選擇為2.0 h左右較為適合。

3.2.2 料液比對TPCK-胰蛋白酶酶解效果的影響 稱取5 g新鮮去殼的縊蟶肉，用pH值為7.8的緩沖溶液作為反應液，酶的添加量為2250 U/g，酶解溫度為37 ℃條件下，分別按料液比1∶1.0、1∶2.0、1∶3.0、1∶4.0、1∶5.0、1∶6.0酶解2.0 h，酶解結果如圖2所示。由圖2可知，料液比從1∶1.0擴大至1∶6.0，多肽提取量呈先上升后下降的變化趨勢。當料液比為1∶3.0時，多肽提取量達到單因素試驗的最高水平。當料液比大于1∶3.0時，反應體系中溶液的增多，減少了TPCK-胰蛋白酶與底物蛋白碰撞接觸的機會，導致多肽提取量下降。因此，料液比選取在1∶3.0左右。

3.2.3 酶添加量對TPCK-胰蛋白酶酶解效果的影響 稱取5g新鮮的去殼縊蟶肉，用pH值為7.8的緩沖溶液作為反應液，酶解溫度為37 ℃，料液比為1∶3.0，酶添加量為4500、9000、13500、18000、22500 U/g條件下，分別酶解2.0 h，酶解結果如圖3所示。由圖3可知，在一定范圍內，隨酶添加量的增加，多肽提取量也相應增加。當酶添加量為18000 U/g時，多肽提取量達到單因素試驗的最高水平。當酶添加量大于18000 U/g時，多肽提取量反而開始降低。這可能是由于TPCK-胰蛋白酶將縊蟶蛋白反應完全后，酶解液中還有適合酶切位點的肽段，TPCK-胰蛋白酶對這些肽段進行酶解，使之降解成游離氨基酸，導致多肽提取量降低。綜上，TPCK-胰蛋白酶的酶添加量選擇為18000 U/g左右。

3.2.4 TPCK-胰蛋白酶酶解工藝的正交試驗優化結果

通過對表2中極差R值進行比較可知，本試驗的3個因素對多肽提取量影響的主次順序為：A＞B＞C，即酶添加量的影響最大，酶解時間的影響最小。由K值比較得最優水平為：A2B3C2。

應用DPS數據處理系統對表2所得數據進行方差分析，分析的結果見表3。由表3可知，本試驗所選取的3個因素對多肽提取量的影響順序為：A＞B＞C，與表2極差分析的結果相一致。由方差分析結果可知，本試驗3個因素對縊蟶多肽提取量都具有顯著的影響。其中，A因素即酶的添加量的影響極顯著。綜合極差分析與方差分析的結果，選擇A2B3C2為最優組合。

表2 TPCK-胰蛋白酶酶解正交試驗結果

表3 TPCK-胰蛋白酶酶解正交試驗方差分析

以優化所得的組合A2B3C2進行3組驗證試驗，試驗結果表明，在最優組合下，縊蟶多肽的平均提取量可達（71.6±0.4）mg/g，表明該酶解工藝優化成功。

4 結論

本研究以多肽提取量為指標，在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗優選TPCK-胰蛋白酶酶解縊蟶的工藝條件，結果表明：

TPCK-胰蛋白酶酶解縊蟶的最佳酶解工藝為：pH=7.8、酶添加量18000 U/g、料液比（m∶V）為1∶3.5、酶解溫度37 ℃、酶解時間2.0 h。在此最優酶解的工藝條件下，每克去殼鮮縊蟶肉可提取（71.6±0.4）mg多肽。在對TPCK-胰蛋白酶酶解縊蟶的工藝條件進行顯著性分析時，發現酶添加量、料液比、酶解時間對TPCK-胰蛋白酶酶解縊蟶的效果都具有顯著影響，因此在TPCK-胰蛋白酶酶解縊蟶的過程中，應注意酶添加量、料液比、酶解時間的控制。