飼料及食品添加劑中三聚氰胺的高效液相色譜-質譜法檢測

朱麗君，肖彩琴

（1.蘭州職業技術學院，甘肅蘭州 730070；2.酒泉職業技術學院，甘肅酒泉 735000）

普通蛋白質含氮量只有16%，但三聚氰胺含氮量可達66.7%，為提高飼料中蛋白質的含氮量，部分非法分子將三聚氰胺添加到飼料和食品中。動物長期攝入含三聚氰胺的飼料，會產生很大的毒性作用。動物會不僅出現腎衰竭而死亡，而且會危害人體健康。我國明令禁止在任何飼料中添加以三聚氰胺等為原料的“蛋白精”。檢測三聚氰酸的常用方法有GC-MS/MS 法、LC-MS/MS法、HPLC法等。目前只有農業行業有對飼料中三聚氰胺殘留的標準，國家標準尚沒有。GC-MS法、HPLC法是農業行業標準中的規定方法。GC-MS法的前處理比較繁瑣，需衍生化。飼料及食品添加劑中有復雜的基質成分，存在許多干擾因素，影響檢測結果。本文優化質譜條件，應用高效液相色譜-質譜法（HPLC-MS），為從源頭控制飼料及食品安全提供保障。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 三聚氰胺分析純，不低于99.5%的純度。稱取10 mg三聚氰胺，使用10 mL容量瓶，設置三聚氰胺標準溶液，作為標準儲備液，用流動相定容。分析純為甲酸、乙醇。使用儀器為安捷倫1100LC-Trap-XCT系統。

1.2 處理樣品 在批發市場購買飼料與食品樣品。粉碎樣品，將5 g樣品放入具塞錐形瓶中。加入20 mL體積比1∶1的水-乙醇溶液，含體積分數0.1%的甲酸。10 min超聲波振蕩，然后過濾，使用20 mL上述提取液再次提取殘渣。過濾，合并濾液。定容至 5 mL。使用氮吹儀上濃縮，使用濾膜0.45μm過濾。

1.3 檢測條件 質譜條件：掃描范圍為m/z44-150。4.0×105Pa的霧化器壓力，97.4 V的毛細管出口電壓，3909 V的毛細管電壓，正離子化模式的電噴霧電離，9 L/min的干燥氣流量，0.5 V的碎裂電壓，350℃的干燥氣溫度。

色譜條件：體積比5∶95，流動相為乙腈-0.1%甲酸。色譜柱Kromasil-C18柱，5μm，4.6 mm×250 mm，進樣量 5μL，0.4 mL/min的流速。

2 結果

2.1 優化質譜條件 三聚氰胺一級質譜：取三聚氰胺標準溶液，50 mg/L。向電噴霧質譜注入。方式為流動注射。母離子全掃描，選取負離子模式、正離子模式，進行比較分析。相比負離子峰強度，正離子模式更高，相差3個數量級。獲得三聚氰胺的準分子離子很強，采取檢測正離子模式，m/z127。

三聚氰胺的二級質譜：選取條件，碎裂電壓0.2～2.0 V；毛細管出口電壓 50～300 V；Skimmer電壓15～100 V。電噴霧電壓1500～4500 V。優化質譜條件，二級質譜為以m/z127為母離子。獲得所需理想質譜條件。碎片離子豐度比2∶1。主要碎片離子m/z85和109。進行定性確證，定量為提取的離子質量色譜峰面積，包括 m/z 127、109、85 離子。

2.2 選擇色譜分離條件 甲醇-水作三聚氰胺的流動相，作為一種強極性化合物，三聚氰胺的胺基有許多。在C18柱上基本沒有保留，很難分離三聚氰胺與溶劑，幾乎同時流出三聚氰胺與溶劑。添加甲酸在流動相中，為改善分離，使用甲酸為離子對試劑。加入甲酸可以提升靈敏度，促進三聚氰胺分子離子化。為獲取穩定的保留時間，使用250 mm的柱子。

2.3 選擇樣品提取方法 對比多次提取樣品的方法，前處理條件為粉碎樣品，將5g樣品放入具塞錐形瓶中，加入20 mL體積比1∶1的水-乙醇溶液，含體積分數0.1%甲酸，10 min超聲波振蕩，然后過濾。使用20 mL上述提取液再次提取殘渣，過濾，合并濾液。定容至5 mL。使用氮吹儀上濃縮，使用濾膜0.45μm過濾，加入乙醇，減少干擾，促進水溶性蛋白的沉淀，加入甲酸，提升三聚氰胺的萃取率。使用MS/MS方法，可直接上機分析樣品提取液。

2.4 線性范圍與檢出限 稀釋三聚氰胺標準貯備液，使用流動相操作，形成 0.5、0.25、0.1、0.05、0.01 m，相關系數0.9993。回歸方程A=61956 ρ+49 958。線性關系處于0.01～0.5 mg/L，呈現良好的范圍。0.01 mg/L為三聚氰胺檢出限。處理樣品，0.01 mg/kg為定量下限。

2.5 精密度與回收率實驗 將飼料樣品分成3組，每組3份。每組樣品加入三聚氰胺標準溶液，分別為 0.5、0.1、0.01 mg/kg。處理后檢測每個樣品。每個樣品檢測3次，相對標準偏差1.6%～5.1%。回收率為82%～99%。

2.6 實際樣品測定 檢測樣品為100多個飼料和食品添加劑。顯示三聚氰胺含量0.11×104～4.5×104mg/kg。部分樣品中含有三聚氰胺，檢測結果如下表。對于樣品與標準品的離子流色譜圖，如下圖。

表1 實際樣品三聚氰胺的測定結果

3 討論

三聚氰胺也稱為三聚氰酰胺、氰脲酰胺、密胺、三胺。無味，白色粉末。分子量126.12。分子式C3N6H6。屬于三嗪類含氮雜環有機化合物。三聚氰胺的相對密度為1570 kg/m3。354℃分解，極微溶于熱乙醇，微溶于冷水，能溶于熱乙二醇、乙酸、甲醇等。不溶于苯、乙醚等。在微堿性或中性環境下，三聚氰胺與甲酵縮合（劉韜等，2017）。三聚氰胺與草酸、鹽酸、乙酸等都能形成鹽，在微酸性環境下，三聚氰胺與經甲基的衍生物生成樹脂產物。三聚氰胺的主要用途是生產阻燃劑、膠水、塑料等，是三聚氰胺甲醛樹脂的原料。部分國家用于制造化肥。在食品和飼料中添加三聚氰胺可冒充蛋白（呂麗卿等，2017）。且凱氏定氮法不能檢出三聚氰胺，被一些不法分子利用。從源頭上監測三聚氰胺是保障人民群眾生命安全、畜牧業健康發展的重要方法（孟繁佳等，2020）。

三聚氰胺在動物體內沒有任何代謝變化。以原型或同系物形式經腎臟排泄。有研究表明，成年雄性大鼠經口給藥三聚氰胺，顯示通過尿液排泄大約90%的給藥劑量。相比血液中的含量，腎臟和膀胱更高，最高的是膀胱。尿液中的消除半衰期為3 h，血液為2.7 h（劉發全等，2019）。有給斷奶仔豬服用三聚氰胺化合物，結果顯示，血漿消除半衰期為4.04 h。三聚氰胺容易經腎臟排泄，對哺乳動物來說，三聚氰胺是低毒、微毒類化學物質。經口給予大鼠三聚氰胺，致死量為3.16 g/kg。經口給予小鼠三聚氰胺，致死量為4.55 g/kg。大鼠拌料口服14 d無不良反應的劑量是417 mg/（kg·d）。小鼠拌料口服13周1600 mg/（kg·d）為無不良反應劑量。大鼠吸入80～1130 mg/m3，每周6次，每日2次，持續超過4個月開始出現腎功能紊亂、中樞神經系統紊亂，體重增加遲滯，對腎臟造成損傷。三聚氰胺會引起試驗動物腎衰竭。長期攝入三聚氰胺會導致腎部、膀胱出現結石，損害泌尿系統、生殖系統，進一步誘發膀胱癌。美國食品藥品管理局研究認為，同時含有三聚氰酸、三聚氰胺會威脅嬰兒健康（商軍等，2019）。因此規定配方奶粉三聚氰胺含量不能高于百萬分之一，同時不得含有其他相近的化學品。

飼料和食品中違法添加三聚氰胺會危害畜牧業的發展和人民群眾身體健康。飼料和食品中添加三聚氰胺會造成營養虛高現象。使用添加三聚氰胺的飼料會降低畜禽生產水平，且長期使用容易導致動物中毒、結石等，給養殖戶造成巨大損失（范艷等，2019）。要從畜禽養殖源頭上檢測三聚氰胺。保障畜禽產品安全，為農業執法提供依據。目前還沒有國家標準的三聚氰胺檢測方法。農業行業標準是用氣質聯用法確診，用高效液相色譜法檢測。高效液相色譜法應用廣泛，基本上所有的化合物都可使用。氣相色譜-質譜法（GC-MS）需要衍生，影響效果和準確性。高效液相色譜-質譜法抗干擾能力強，并且能夠確定性、定量，靈敏度高，準確性高。

4 總結

綜上所述，本文研究采用高效液相色譜-質譜法檢測飼料和食品添加劑中的三聚氰胺。回收率為82%～99%，相對標準偏差1.6%～5.1%，靈敏度和準確度較好。高效液相色譜-質譜法處理簡單，操作性強，有利于三聚氰胺的檢測。