超高效液相色譜在香蕉皮多酚物質(zhì)提取分離中的應(yīng)用

陸 嫣

(梧州學(xué)院 化學(xué)工程與資源再利用學(xué)院，廣西 梧州 543002)

香蕉富含多種有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、油脂類、糖類、維生素以及多種酚類，同時(shí)還含有豐富的K，Ca，Mg等金屬元素，上述各類營養(yǎng)物質(zhì)成為香蕉加工企業(yè)的重要副產(chǎn)品，有較高的營養(yǎng)價(jià)值和保健功能[1]。尤其是香蕉皮所含的多酚，抗氧化作用較強(qiáng)，具有良好的抗衰老、抗癌、抗炎、抗過敏、抑制膽固醇上升等功能，被廣泛地應(yīng)用于化妝品、醫(yī)藥、食品、保健品等行業(yè)[2-3]。通常香蕉皮質(zhì)量約占整個(gè)果實(shí)質(zhì)量的1/3，人們在食用香蕉時(shí)往往將皮當(dāng)做垃圾處理，不僅造成了環(huán)境污染，同時(shí)還浪費(fèi)了資源。隨著近年來香蕉皮產(chǎn)業(yè)和加工技術(shù)的發(fā)展，香蕉皮中的有用成分，如多酚，被提取利用。香蕉皮中多酚組分的提取使香蕉皮變廢為寶，還有利于新藥物的研發(fā)，節(jié)約了資源[4]。

目前，關(guān)于植物中多酚提取的方法有很多，如溶劑提取法、超聲波輔助提取法、生物酶解提取法、超臨界流體萃取法、膜技術(shù)提取法、離子沉淀法等[5]。而常用的多酚測定方法有薄層色譜法、紫外分光光度法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法。不同測定方法各有利弊，如薄層色譜法和紫外分光光度法僅能測定單一多酚或者多酚的總量，無法測定多酚的具體種類以及相應(yīng)含量[6-7]。鑒于此，本研究選擇超高效液相色譜(UPLC)法來測定香蕉皮的多酚組分，該方法不僅準(zhǔn)確度高，還有很好的重復(fù)性，同時(shí)操作非常簡便，可以同時(shí)對植物中的多種多酚進(jìn)行測定[8]。

1 超高效液相色譜

超高效液相色譜(UPLC)是分離科學(xué)中產(chǎn)生的一個(gè)新領(lǐng)域，但其使用原理和理論與高效液相色譜基本相同。它不僅包含了低系統(tǒng)體積、小顆粒填料、快速檢測手段等全新的技術(shù)，還加入了色譜峰容量、分析通量、靈敏度等。因此，超高效液相色譜可以依據(jù)離子交換、分配、篩析、吸附、親和等原理進(jìn)行分離樣品[9]。目前使用較多的是UPLC-PDA分離檢測法，特別是在黃酮類、兒茶素類等組分分離檢測中。另外，基于1.7μm小顆粒技術(shù)的UPLC雖然與常用的HPLC的分離原理基本相同，但是前者具有更強(qiáng)的分離能力，可滿足人們對分離速度和分離度的要求，可以在很快的流速和線速度以及反壓情況下完成高效分離。其優(yōu)點(diǎn)主要有以下方面。

(1)超高分離度?；?.7μm顆粒使用，其提供的柱效更為高效，是5μm顆粒的3倍以上，并且因?yàn)轭w粒變小，分離度顯著增加，在梯度分離中也是如此，同樣具有明顯的優(yōu)越性，即分離能力增大，峰容量增加，可以分離出更多的色譜峰，從而使人們對樣品的認(rèn)識(shí)水平到達(dá)新的高度，同時(shí)還縮短了產(chǎn)品開發(fā)時(shí)間。

(2)超高速度。因?yàn)橄到y(tǒng)采用的顆粒只有5μm的1/3，所以在柱效保持不變的情況下，色譜柱長度可以縮短1/3，而分離速度則可以增大約3倍，實(shí)現(xiàn)了分離度不變而分離時(shí)間縮短，這使得整個(gè)分析過程變得更加高效。

(3)超高靈敏度。因?yàn)樾☆w粒技術(shù)的使用，改變了以往色譜柱的柱效，大大改善了分離度以及相對較窄的色譜峰寬度，即具有高靈敏度。得益于此，峰寬較窄，會(huì)相應(yīng)地增加峰高，在快速分析過程中，峰高越明顯，越便于研究者分析。與HPLC相比，UPLC技術(shù)可以在提高分離度的同時(shí)，進(jìn)一步增加分離的靈敏度。所以，UPLC法可以用于研究植物中多酚以及類胡蘿卜素等物質(zhì)的分離檢測。綜上所述，UPLC的高靈敏度和分離效果非常適合香蕉皮中多酚物質(zhì)的提取分離，本試驗(yàn)采用UPLC完成研究工作。

2 超高效液相色譜在香蕉皮多酚物質(zhì)提取分離中的應(yīng)用

香蕉汁液成分非常復(fù)雜，而且目標(biāo)對象的含量又較低，一般情況下，樣品制備中提取率通常比較低，而且操作繁瑣，需要耗費(fèi)大量的溶劑。尤其是在香蕉皮等果皮中，多酚物質(zhì)含量本來較低，提取非常困難，即使能提取，效率也極其低下，嚴(yán)重影響了測定工作。所以，如何能快速準(zhǔn)確地測定香蕉皮中多酚物質(zhì)的含量對其綜合利用有著很重要的現(xiàn)實(shí)意義和經(jīng)濟(jì)意義[10-11]。而超高效液相色譜則剛好能夠解決上述問題，其高效分離和高靈敏度在香蕉皮多酚組分提取中得到了廣泛的應(yīng)用。

試驗(yàn)儀器與材料：湖南赫西TGL20MW臺(tái)式大容量高速冷凍離心機(jī)，上海亞榮RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，美國華志HZY-B電子天平，上海析達(dá)HH-2恒溫水浴鍋，Waters alliance_acquity e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)；鮮香蕉皮(本地產(chǎn))，無水乙醇(滬試 分析純)，蒸餾水、甲酸(滬試 色譜純)，甲醇(滬試 色譜純)。

2.1 香蕉皮多酚物質(zhì)的提取分離

現(xiàn)階段，植物多酚的提取分離工藝方法較多，各有利弊，目前有溶劑萃取法、超臨界流體萃取法、超聲波浸提法和微波浸提法等，本研究選用操作簡單易行的溶劑萃取法[12-13]。選用無毒型溶劑——乙醇作為萃取劑。

2.1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果。有研究表明該溶劑萃取過程受乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提溫度、浸提時(shí)間、料液比等條件的影響，通過正交試驗(yàn)方法，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間、料液比為考察的4個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)3水平。以多酚提取率為指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(見表1)，得出最佳浸提條件。

表1 香蕉皮多酚提取分離正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)結(jié)果顯示，影響浸提效果的因素影響大小為乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取溫度>提取時(shí)間>料液比。得到香蕉皮多酚的最佳提取方案為提取溶劑為80%乙醇、料液比1∶4(g∶mL)、提取溫度為80℃、提取時(shí)間120 min。

2.1.2 最佳提取工藝的確定。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，確定最佳提取工藝如下：稱取10 g香蕉皮，切片、沸水中浸泡5 min，以鈍化多酚氧化酶的活性，香蕉皮破碎均質(zhì)，用40 g體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇水溶液浸提，80℃水浴條件下不斷攪拌，持續(xù)120 min，然后過濾合并濾液，離心，減壓蒸餾濾液回收乙醇，冷卻得香蕉皮中的多酚物質(zhì)。

2.2 超高效液相色譜的測試條件

因?yàn)橄憬镀さ某煞謴?fù)雜，影響其多酚物質(zhì)分離的因素也較多，所以在進(jìn)行色譜分離之前需要對測試條件進(jìn)行優(yōu)化處理。如張晉芬等[14]人在研究和測定香蕉、梨以及蘋果中8種多酚物質(zhì)時(shí)，為了避免由于干擾和影響而產(chǎn)生較大的誤差，對色譜進(jìn)行相應(yīng)的處理，進(jìn)行色譜優(yōu)化。

2.2.1 洗脫梯度?？紤]到各組分極性差別較大，等度洗脫無法滿足本次試驗(yàn)要求，在多次試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)定：0～20 min(5%～70%)，以滿足樣品中各組分能夠達(dá)到基準(zhǔn)線。

2.2.2 檢測波長的確定。根據(jù)文獻(xiàn)研究結(jié)果，多酚物質(zhì)在吸光度為190～400 nm時(shí)，且在波長為280 nm處達(dá)到最大吸光度，因此設(shè)定檢測波長為280 nm。

2.2.3 流動(dòng)相流速。分別將流速定為0.6，0.8，1.0 mL/min，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)流速為0.8 mL/min時(shí)具有最好的出峰效果。

2.2.4 配制樣品溶液時(shí)采用的甲醇含量。因?yàn)樵囼?yàn)采取的是梯度洗脫，甲醇溶劑在流動(dòng)相里的變化非常大，往往會(huì)導(dǎo)致拖尾峰或者前延峰等問題。研究發(fā)現(xiàn)，在樣品溶液中甲醇的含量為30%時(shí)，可以減弱這種現(xiàn)象，從而得到良好的效果。并在此色譜條件下進(jìn)行對比研究，對照品和樣品色譜見圖1。

a.沒食子酸；b.原兒茶酸；c.兒茶素；d.綠原酸；e.表兒茶素；f.咖啡酸；g.阿魏酸；h.蘆丁

試驗(yàn)結(jié)果顯示，在此條件下，8種多酚物質(zhì)可以達(dá)到較好的分離效果，故本研究在測試之前，通過對上述影響因素進(jìn)行分析，確定本研究的最優(yōu)色譜條件如下[15]：PDA檢測器，檢測波長280 nm，進(jìn)樣量2 μL，進(jìn)樣溫度15℃，柱溫35℃，流速0.45 ml/min，色譜柱Acquityuplcbeh C182.1mm×50.0mm，1.7μm，流動(dòng)相為A.甲醇，B.甲酸(0.2%)。梯度洗脫程序：0～1 min：甲醇∶甲酸(10%∶90%)；1～3 min：甲醇∶甲酸(20%∶80%)；3～5 min：甲醇∶甲酸(50%∶50%)5～7.5 min：甲醇∶甲酸(30%∶70%)7.5～10 min：甲醇∶甲酸(10%∶90%)。按照上述的試驗(yàn)方法和條件，分別測定了16種多酚物質(zhì)的響應(yīng)特性，并求得標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。

表2 多種酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低檢出限

在此條件下各類多酚標(biāo)準(zhǔn)品在高效液相色譜中液取得較好的分離效果，見圖2、圖3。

a.沒食子酸；b.四羥基苯甲酸；c.兒茶素；d.咖啡酸；e.表兒茶；f.蘆丁；g.根皮苷；h.反式肉桂酸；i.根皮素

j.二輕基苯甲酸；k.綠原酸；l.丁香酸；m.對香豆素；n.阿魏酸；o.鞋花酸；p.懈皮素

3.3 分析結(jié)果

對以上提取的香蕉皮多酚進(jìn)行超高效液相色譜分析，結(jié)果見圖4。

結(jié)果確認(rèn)并檢測到提取液中11種多酚物質(zhì)(見圖4)。其含量如下：兒茶素.0.435 mg/g；表兒茶.1.027 mg/g；蘆丁.0.674 mg/g；綠原酸.1.345 mg/g；咖啡酸.0.320 mg/g；丁香酸.0.238 mg/g；對香豆酸.0.149 mg/g；阿魏酸.0.260 mg/g；二羥基苯甲酸.0.341 mg/g；反式肉桂酸.0.026 mg/g；根皮素.0.014 mg/g。

c.兒茶素；d.咖啡酸；e.表兒茶；f.蘆?。籬.反式肉桂酸；i.根皮素；j.二輕基苯甲酸；k.綠原酸；l.丁香酸；m.對香豆素；n.阿魏酸

3 結(jié)論

香蕉富含的多酚有較強(qiáng)的抗氧化作用，具有較高的藥用價(jià)值。香蕉多酚現(xiàn)有多種提取分離工藝和分析方法，如SP法、FL法、TLC法等，這些方法設(shè)備簡單，操作方便，但是都不能對化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行精確的定性定量，往往測定的是一類化合物的總量，并且無法消除雜質(zhì)干擾，無法滿足對多種物質(zhì)的分離和精確檢測。超高效液相色譜(UPLC)在香蕉皮中多酚物質(zhì)提取分離中的檢測應(yīng)用，前處理簡單，檢測速度快，適合檢測香蕉中大多數(shù)活性成分。對于多酚等物質(zhì)分離效果好，靈敏度高，但是測試時(shí)需根據(jù)自身要求優(yōu)化檢測條件。本研究在優(yōu)化的測試條件下，使香蕉皮中多酚物質(zhì)得到較好的分離，確認(rèn)并檢測到提取液中11種多酚物質(zhì)，其含量分別為兒茶素.0.435 mg/g；表兒茶.1.027 mg/g；蘆丁.0.674 mg/g；綠原酸.1.345 mg/g；咖啡酸.0.320 mg/g；丁香酸.0.238 mg/g；對香豆酸.0.149 mg/g；阿魏酸.0.260 mg/g；二羥基苯甲酸.0.341 mg/g；反式肉桂酸.0.026 mg/g；根皮素.0.014 mg/g。