滋腎活血方對血管性癡呆大鼠BDNF/TrkB/PI3K/Akt信號通路的影響

張發友，伍大華，葛金文，劉春華，謝瑤，鄧毫斌，周衛強

論著·實驗研究

滋腎活血方對血管性癡呆大鼠BDNF/TrkB/PI3K/Akt信號通路的影響

張發友1，2，伍大華1，2，葛金文1，劉春華1，謝瑤2，鄧毫斌2，周衛強2

1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥研究院附屬醫院，湖南 長沙 410006

觀察滋腎活血方對血管性癡呆（VD）大鼠BDNF/TrkB/PI3K/Akt信號通路的影響，探討其可能的作用機制。采用改良的雙側頸總動脈結扎法（2-VO法）建立大鼠VD模型，將大鼠隨機分為假手術組、模型組、滋腎活血低劑量組、滋腎活血高劑量組和奧拉西坦組，每組8只。給藥28 d后，HE染色觀察大鼠海馬組織CA1區變化，免疫組化和Western blot分別檢測大鼠腦組織p-Akt、Akt、TrkB和BDNF蛋白的表達。HE染色結果：與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織CA1區損傷較嚴重，細胞核破裂，胞質濃縮，胞體變小；與模型組比較，滋腎活血低劑量組、滋腎活血高劑量組和奧拉西坦組大鼠海馬組織CA1區損傷均明顯減輕；免疫組化染色結果：與假手術組比較，模型組大鼠腦組織p-Akt和Akt蛋白表達均明顯升高（＜0.05），TrkB和BDNF蛋白表達均明顯降低（＜0.05）；與模型組比較，滋腎活血低劑量組、滋腎活血高劑量組和奧拉西坦組大鼠腦組織p-Akt和Akt蛋白表達均明顯降低（＜0.05），TrkB和BDNF蛋白表達均明顯升高（＜0.05）；Western blot檢測結果：與假手術組比較，模型組大鼠腦組織p-Akt蛋白表達顯著升高（＜0.05），TrkB和BDNF蛋白表達均明顯降低（＜0.05）；與模型組比較，滋腎活血低劑量組、滋腎活血高劑量組和奧拉西坦組大鼠腦組織p-Akt蛋白表達均明顯降低（＜0.05），TrkB和BDNF蛋白表達均明顯升高（＜0.05）。滋腎活血方可提高VD大鼠學習記憶能力，其機制可能與下調VD大鼠腦組織p-Akt、Akt和上調TrkB、BDNF蛋白的表達有關。

滋腎活血方；血管性癡呆；蛋白激酶；腦源性神經營養因子；大鼠

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是一種常見于腦動脈粥樣硬化或腦卒中后的綜合征，是由各種腦血管病變所致的智力障礙[1]。VD主要表現為記憶和認知功能障礙，伴運動、語言、視覺或人格障礙[2-3]。其發病機制與缺血性腦損傷引起的神經元變性、凋亡或壞死有關[4]，迄今尚未發現有效的治療方法。有研究報道，腦源性神經營養因子（BDNF）缺乏開始于VD早期，最終導致其晚期神經元變性、細胞死亡和膽堿能神經傳遞喪失[5]。BDNF與學習記憶過程密切相關，分布于中樞神經系統之內，可通過多條信號途徑在神經發育過程中促進分化、存活，從而保護神經元改善病理狀態。有證據表明，BDNF的表達在VD患者和VD動物模型中受損[6]。外源性添加BDNF可在體外和體內挽救神經元死亡并預防β-淀粉樣蛋白誘導的神經變性[7]。BDNF通過結合酪氨酸激酶受體B（TrkB）發揮促生存作用，TrkB誘導的磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）活性進一步使Akt活化[8]，進而使Bcl-2、Bad等促凋亡靶點磷酸化失活。課題組前期研究發現，滋腎活血方可改善VD大鼠學習記憶能力[9]，但其潛在機制尚未明確。本實驗在前期研究的基礎上觀察滋腎活血方對VD大鼠BDNF/TrkB/ PI3K/Akt信號通路的影響，探討其治療VD的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

雄性健康SD大鼠40只，體質量（200±20）g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2013-0004。飼養于溫度20～25 ℃、相對濕度50%～70%環境，光照12 h，自由攝食飲水。

1.2 藥物

滋腎活血方（枸杞子30 g，制何首烏15 g，益智仁10 g，桑椹30 g，葛根30 g，丹參30 g，山楂15 g，石菖蒲10 g，郁金10 g，遠志10 g，全蝎3 g，五味子5 g），飲片購自湖南省中醫藥研究院附屬醫院中藥房。臨床成人建議用量為198 g/d，臨床動物每日等效劑量為17.6 g/kg，本實驗高劑量為17.6 g/（kg?d）、低劑量為8.8 g/（kg?d），由本院藥劑科制成2.00 g/mL溶液。奧拉西坦片，規格0.4 g/片，石藥集團歐意藥業有限公司，批號20180516；臨床成人建議用量為2.4 g/d，臨床動物等效劑量為216 mg/（kg?d），按體表面積換算，將其配成濃度為24.00 mg/mL的懸浮液。

1.3 主要試劑與儀器

一抗稀釋液，上海碧云天生物技術有限公司，貨號P0205；BCA蛋白定量試劑盒，北京索萊寶科技有限公司，貨號PC0020；SDS-PAGE試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司，貨號P0012AC；ECL化學發光試劑盒，美國Pierce公司，貨號20-500；兔抗p-Akt抗體，北京博奧森生物技術有限公司，貨號bsm-52130R；兔抗NTRK抗體，北京博奧森生物技術有限公司，貨號bs-0176R；兔抗BDNF抗體，北京博奧森生物技術有限公司，貨號bs-4989R；兔抗Akt抗體，北京博奧森生物技術有限公司，貨號bsm-33278m；兔抗β-actin抗體，北京博奧森生物技術有限公司，貨號bs-10966R；HRP標記羊抗兔，北京博奧森生物技術有限公司，貨號bs-0295P-HRP；多聚甲醛，國藥集團化學試劑北京有限公司，貨號80096675；免疫組化檢測試劑盒，美國CST公司，貨號8109。Mini-protean Tetra System垂直電泳槽轉膜儀，美國Bio-Rad公司；Mini trans-blot小型濕轉印槽，美國Bio-Rad公司；ChemiDocTMXRS+凝膠成像系統，美國Bio-Rad公司；Max200超級酶標儀，美國Bio-Tek公司；TE2000-U+DXM1200倒置顯微鏡，日本Nikon公司；Z36HK高速冷凍離心機，德國HermLe公司。

1.4 造模

采用改良的雙側頸總動脈結扎法（2-VO法）制備VD大鼠模型[5]。手術造模前，大鼠禁水4 h并禁食12 h。大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉并固定于板上，沿頸部中線切開，鈍性解剖暴露左側頸總動脈，并用手術線雙重結扎。7 d后，進行相同手術并結扎右側頸總動脈。術后3 d青霉素鈉50萬U/kg腹腔注射。假手術組大鼠僅分離血管而不結扎。

1.5 分組及給藥

取SD大鼠40只，采用隨機數字表法選出8只作為假手術組，剩余32只大鼠造模。假手術組和VD大鼠造模期間無大鼠死亡，32只大鼠均經水迷宮篩選出VD大鼠。將成模大鼠按隨機數字表法分為模型組、奧拉西坦組、滋腎活血低劑量組、滋腎活血高劑量組，每組8只。大鼠按9 mL/（kg?d）劑量給予相應藥物灌胃。其中假手術組給予蒸餾水灌胃，滋腎活血低劑量組給予滋腎活血方8.8 g/（kg?d）灌胃，滋腎活血高劑量組給予滋腎活血方17.6 g/（kg?d）灌胃，奧拉西坦組給予奧拉西坦藥液216 mg/（kg?d）灌胃。藥物劑量參照文獻[9]計算。每日1次，連續4周。

1.6 取材

大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，迅速打開胸腔，解剖切口用止血鉗固定并牽拉皮膚使心臟充分暴露于視野。將靜脈滴注針頭自左心室插入心臟，穿入至升主動脈，用止血鉗固定針頭，同時剪破右心耳。用37 ℃生理鹽水150～250 mL經升主動脈快速灌注沖洗，至動脈中液體變清亮，加入4%多聚甲醛0.1 mol/L PBS，直到大鼠四肢完全僵硬，取出全腦，用于HE染色。取新鮮海馬，大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，斷頭后在冰盒上快速剝離腦組織，分離海馬，將海馬組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，冠狀切片，用于Western blot、免疫組化檢測。

1.7 HE染色

大鼠處死后取腦，分離海馬，將海馬組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，染色5～10 min，沖洗，鹽酸乙醇分色；自來水浸泡返藍5 min，沖洗，干燥，封片，鏡檢。

1.8 免疫組化檢測

按免疫組化試劑盒說明書進行操作，脫蠟、水化組織切片→對切片預處理→孵育10 min（3%H2O2去離子水）→PBS洗滌2 min×3次→滴加一抗，37 ℃孵育1～2 h，PBS沖洗2 min×3次→滴加試劑1，37 ℃孵育20 min，PBS洗滌2 min×3次→滴加試劑2，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗2 min×3次→DAB溶液顯色→沖洗、復染、脫水、透明、封片→圖像分析。免疫組化染色陽性表達成分在圖像上呈棕黃色顆粒，以平均光密度值來表示。

1.9 Western blot檢測

用干凈的高溫消毒剪刀將大腦組織剪碎放入試管。加入適量的裂解液后進行充分裂解，在冰上使其充分混勻，根據上述方法將其至少重復3次，使其盡量充分裂解。冰上裂解30 min，將混合的裂解液4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取上清液，分裝于無菌離心管，置于-80 ℃冰箱保存備用。BCA法測定蛋白濃度。用SDS-PAGE制膠試劑盒，配制8%分離膠、5%濃縮膠，每孔上樣蛋白30 μg電泳，將蛋白轉至PVDF膜，TBST洗膜5 min×3次。用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST再洗膜8 min×3次。孵育一抗（1∶1000 p-Akt，1∶1000 Akt，1∶1000 TrkB，1∶1000 BDNF，1∶10 000 β-actin），4 ℃孵育過夜。TBST再洗膜10 min×3次，二抗室溫孵育2 h，TBST再洗膜20 min×3次。用化學發光法顯影曝光，凝膠成像系統掃描分析，以目的蛋白與內參β-actin灰度值之比表示蛋白的相對表達量。

1.10 統計學方法

2 結果

2.1 HE染色結果

假手術組大鼠海馬CA1區錐體細胞形態完整，絕大部分細胞呈圓形，可見少量橢圓形，細胞核大，核仁較清晰，細胞排列整齊，結構較為完整；模型組大鼠海馬CA1區絕大部分錐體細胞形態消失，排列較為分散，細胞層次減少，視野可見細胞旁有空染區，細胞核破裂，胞質濃縮，胞體變小；奧拉西坦組大鼠海馬CA1區錐體細胞形態較模型組完整，細胞排列較為整齊，層次較模型組清晰；滋腎活血低、高劑量組較模型組大鼠海馬CA1區錐體細胞形態完整，細胞排列較為整齊，層次較清晰，細胞無空染區，細胞核較完整，細胞數目顯著增多。見圖1。

2.2 免疫組化染色結果

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織p-Akt和Akt平均光密度均明顯升高（＜0.05），TrkB和BDNF平均光密度均明顯降低（＜0.05）；與模型組比較，滋腎活血低劑量組、滋腎活血高劑量組和奧拉西坦組大鼠腦組織p-Akt和Akt平均光密度均明顯降低（＜0.05），TrkB和BDNF平均光密度均明顯升高（＜0.05）。結果見表1、圖2。

2.3 滋腎活血方對大鼠腦組織相關蛋白表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織p-Akt蛋白表達顯著升高（＜0.05），TrkB和BDNF蛋白表達均明顯降低（＜0.05）；與模型組比較，滋腎活血低劑量組、滋腎活血高劑量組和奧拉西坦組大鼠腦組織p-Akt蛋白表達明顯降低（＜0.05），TrkB和BDNF蛋白表達均明顯升高（＜0.05）。結果見圖3、圖4。

圖1 各組大鼠海馬組織形態（HE染色，×400）

表1 各組大鼠腦組織p-Akt、Akt、TrkB、BDNF平均光密度比較（±s）

注：與假手術組比較，#＜0.05；與模型組比較，*＜0.05

圖2 各組大鼠腦組織Akt、p-Akt、TrkB、BDNF陽性表達（免疫組化染色，×400）

注：A.假手術組；B.模型組；C.奧拉西坦組；D滋腎活血低劑量組；E.滋腎活血高劑量組；與A比較，#P＜0.05；與B比較，*P＜0.05

注：A.假手術組；B.模型組；C.奧拉西坦組；D滋腎活血低劑量組；E.滋腎活血高劑量組；與A比較，#P＜0.05；與B比較，*P＜0.05

3 討論

目前，VD是腦血管疾病中與多種危險因素有關的一種疾患，雖然其具有可預防性的特點，但病死率高，發病率也逐年上升，其特征在于記憶障礙、視覺空間障礙、注意力障礙和執行功能障礙。海馬是一個大腦記憶的關鍵區域，海馬組織受損會導致記憶力顯著下降，嚴重者亦可導致VD。有研究顯示，海馬CA1區是學習記憶的主要功能區[10]。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠CA1區受損較為嚴重，細胞核破裂，胞質濃縮，胞體變小；與模型組比較，滋腎活血方干預后VD大鼠CA1區細胞形態較為完整，排列較為整齊，層次較清晰，細胞數量顯著增多，提示滋腎活血方可改善VD大鼠海馬CA1區損傷。

BDNF是一種具有生物學功能的神經營養因子，支持中樞和周圍神經元生存，內源性BDNF在腦缺血后可縮小腦組織缺血性損傷，外源性BDNF在腦梗死后可有效縮小梗死體積。BDNF對神經存活、學習、記憶、突觸活動等有調節作用已被證實[11]。BDNF與學習記憶過程密切相關，參與長期記憶的形成，在維持學習記憶和調節突觸的可塑性方面具有重要作用[12]。BDNF主要通過TrkB發揮其生理作用，TrkB是一種具有高度親和力的BDNF受體。有研究表明，TrkB信號在記憶的形成中起著至關重要的作用，異常的TrkB表達會損害記憶和學習[13]。BDNF通過與TrkB結合后構成二聚體，并在同一時間誘導TrkB使其磷酸化，以便細胞內外信號傳遞，誘使下游通路的激活，保證級聯反應的正常，發揮神經保護作用[14]。BDNF通過與TrkB形成的受體復合物相結合，進而發揮其對神經元可塑性促進作用。本研究結果顯示，VD大鼠BDNF和TrkB蛋白表達顯著下降，滋腎活血方可升高VD大鼠BDNF、TrkB蛋白表達，從而激活其自身通路影響下游信號通路，促進對VD大鼠神經元及學習記憶能力的修復，達到保護大鼠海馬神經元的作用。

PI3K/Akt是BDNF/TrkB下游級聯信號中較為關鍵的途徑，被認為可調節NMDA受體介導的突觸可塑性。PI3K/Akt信號通路已被證實對腦組織和細胞缺血缺氧有保護作用。PI3K是可被細胞因子和有絲分裂原刺激激活的生長因子，經激活PKB/Akt的方式參與到調控細胞周期、細胞增殖和凋亡中。Akt也被稱為PKB，是一種能對體內多種信號作出反應的特異性蛋白激酶，它的活化受到生長因子、細胞應激和胰島素等多種因素的影響，并且在其參與的信號通路中起營養代謝、細胞生長、增殖，轉錄調節和細胞存活等功能。Akt各種亞型都在神經系統中高度表達，在神經保護中發揮重要作用。活躍的磷酸化Akt通過升高下游底物的磷酸化，促進神經細胞生存。BDNF、胰島素樣生長因子Ⅰ或神經生長因子等神經營養因子，可引起PI3K/Akt的激活。營養因子與PI3K同源酪氨酸激酶受體結合，產生存活因子，PI3K在該因子的作用下磷酸化并逐漸募集至質膜附近，與此同時，PI3K的磷脂產物與Akt同源結構蛋白相互作用使Akt聚集到質膜內表面，在質膜內表面的PI3K所含的催化亞基產生磷酸肌醇磷酸鹽PIP2和PIP3，從而導致Akt磷酸化激活。活化Akt參與多種細胞功能的調控，而PI3K/Akt信號通路在VD發病中發揮著作用[15]。本研究結果顯示，模型組大鼠磷酸化的Akt蛋白表達顯著升高，由此推測BDNF介導的PI3K/Akt信號通路的活化可能是由腦缺血所誘發的，而活化的BDNF信號通路又和海馬神經的受損密切相關，導致海馬神經進入損傷狀態。滋腎活血方干預后，p-Akt蛋白表達顯著降低，高劑量組更為顯著，且免疫組化結果顯示，滋腎活血方干預后Akt和p-Akt表達顯著降低。Western blot檢測大鼠總蛋白Akt表達無變化，而免疫組化檢測Akt有明顯變化；其可能的原因是Western blot檢測的是組織總蛋白Akt的表達，而免疫組化屬半定量法，檢測組織中細胞胞漿、胞膜、細胞核等Akt表達。由此推測滋腎活血方通過調控BDNF介導的PI3K/Akt信號通路，從而對大鼠神經元起到保護作用，對受損VD大鼠記憶功能有所改善。

國醫大師劉祖貽認為，VD病位在腦，屬本虛標實之證[16]。腎精虧虛、瘀血阻絡為其常見病機，臨床運用滋腎活血方治療VD療效顯著[17]。方中制何首烏滋陰補血，有化陽之功而無陰凝之弊，可獲陰陽雙補之效，枸杞子有滋補肝腎、益精明目之功，兩者共為君藥；桑椹滋陰養血，益智仁助陽化陰，鼓舞腎氣以生精，可使化源得滋，腦髓得充，共為臣藥；葛根輕清升陽，丹參活血祛瘀，五味子滋腎澀精，遠志寧心安神，石菖蒲開竅寧神，全蝎搜風通絡，六藥為佐；郁金活血化瘀，山楂消食健胃，共為使藥。全方共奏活血通竅、滋陰補腎、益智健腦之效。

綜上所述，滋腎活血方可通過提高BDNF、TrkB和降低p-Akt蛋白表達，從而對大鼠神經元起到保護作用，改善VD大鼠海馬損傷。

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Effects ofPrescription on BDNF/TrkB/PI3K/Akt Signaling Pathways in Vascular Dementia Rats

ZHANG Fayou1,2, WU Dahua1,2, GE Jinwen1, LIU Chunhua1, XIE Yao2, DENG Haobin2, ZHOU Weiqiang2

To explore the effects ofPrescription on BDNF/TrkB/PI3K/Akt signal pathways in vascular dementia (VD) rats; To discuss its possible mechanism.The modified bilateral common carotid artery ligation method (2-VO method) was used to establish rat VD models, and the rats were randomly divided into sham-operation group, model group,low-, high-dosage groups, and Oxiracetam group, with 8 rats in each group. 28 days after administration, HE staining was used to observe the changes in the CA1 region of rat hippocampus. Immunohistochemistry and Western blot were used to detect the protein expressions of p-Akt, Akt, TrkB and BDNF in the rat brain.The HE results showed that compared with the sham-operation group, the hippocampal CA1 region of the model group was more severely damaged, the nucleus was ruptured, the cytoplasm was concentrated, and the cell body became smaller; compared with the model group, the damage of hippocampal CA1 area was significantly reduced inlow-, high-dosage groups, and Oxiracetam group. Immunohistochemical staining results showed that compared with the sham-operation group, the p-Akt and Akt protein expressions in the model group significantly increased (<0.05), and the TrkB and BDNF protein expressions were significantly reduced (<0.05); compared with the model group, the expressions of p-Akt and Akt inlow-, high-dosage groups, and Oxiracetam group were all reduced (<0.05), and TrkB and BDNF protein expression significantly increased (<0.05). Western blot results showed that compared with the sham-operation group, the expression level of p-Akt protein in the model group significantly increased (<0.05) and TrkB and BDNF protein expression significantly decreased (<0.05); compared with the model group, the expressions of p-Akt and Akt inlow-, high-dosage groups, and Oxiracetam group were all reduced (<0.05), and TrkB and BDNF protein expression significantly increased (<0.05).Prescription can improve the learning and memory abilities of VD rats. The mechanism may be related to the down-regulation of p-Akt and Akt protein expressions and the up-regulation of TrkB and BDNF protein expressions.

Prescription; vascular dementia; protein kinase; brain-derived neurotrophic factor; rats

R285.5

A

1005-5304(2020)10-0042-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202005193

國家自然科學基金（81894462）

伍大華，E-mail：893049352@qq.com

（2020-05-03）

（2020-05-28；編輯：華強）