單面針HPLC指紋圖譜及質量標準研究

劉倩倩，雷思敏，胡玉珍，夏伯候，林艷，林麗美，龔云，張鵬，吳萍

單面針HPLC指紋圖譜及質量標準研究

劉倩倩1，2，雷思敏1，2，胡玉珍1，2，夏伯候1，2，林艷1，2，林麗美1，2，龔云3，張鵬3，吳萍1，2

1.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；2.湘產大宗藥材品質評價湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；3.株洲千金藥業股份有限公司，湖南 株洲 412003

建立單面針藥材的特征指紋圖譜，測定單面針中木蘭花堿、水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物含量，以控制單面針藥材質量，并為與兩面針的區別提供參考。采用HPLC建立基于區分兩面針的單面針指紋圖譜，色譜柱為Athena C18，120A（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相，梯度洗脫，流速1 mL/min，進樣量10 μL，柱溫30 ℃，檢測波長283 nm。采用主成分分析及正交偏最小二乘-判別分析對單面針和兩面針指紋圖譜進行比較，篩選其差異標志物，并利用對照品進行標志物鑒定和含量測定。參照2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）通則方法測定單面針的水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物含量。建立了單面針特征指紋圖譜，發現了區分單面針與兩面針的11個標志性化合物，指認出其中1個標志物為木蘭花堿。木蘭花堿在0.48～5.76 μg范圍內呈良好線性關系（＝1），平均加樣回收率為97.23%，RSD＝1.31%，樣品含量為2.227 3～21.027 2 mg/g。單面針中水分、總灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物、醇溶性浸出物含量分別為5.016%～10.910%、2.487%～5.973%、0.027%～0.147%、0.548%～2.512%、0.332%～2.113%。本研究建立的方法操作簡便，準確性及重復性好，可用于評價單面針藥材的質量。

單面針；高效液相色譜法；質量標準；木蘭花堿

單面針為蕓香科植物蜆殼花椒Hemsley或刺殼花椒Hemsley的干燥根和莖[1]，兩面針為蕓香科植物兩面針（Roxb.）DC.的干燥根[2]169，二者生長于我國廣東、廣西、湖南、云南等山地林中，具有活血散瘀、祛風活絡、續筋接骨功效，用于治療跌打損傷、骨折等[3-4]。單面針與兩面針的化學成分及活性比較相似，但缺乏完善的質量控制標準，與兩面針混淆使用現象嚴重，因此，二者的比較研究具有現實意義。楊鵬等[5]利用高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜技術鑒定出單面針和兩面針中32種生物堿，發現兩者所含生物堿種類相似，且單面針中生物堿苷種類更豐富、含量也較高。陳鐵寓等[6]通過二階導數光譜結合二維傅里葉紅外光譜方法可將兩者完全區分開來。

目前，兩面針已被《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）收錄，單面針僅在2015年版《中國藥典》婦科千金片項下出現[2]902。2009版《湖南中藥材標準》收載單面針，但缺乏專屬性和可定量的指標，無含量測定項[1]。研究表明，單面針具有抗菌、抗乳腺癌等活性[7]。有學者采用HPLC測定單面針中生物堿含量，發現單面針中含量最高的成分為木蘭花堿[8-9]。本試驗在前期研究基礎上，采用HPLC結合化學計量學方法分析單面針與兩面針指紋圖譜，篩選二者的差異性化學成分，對木蘭花堿含量進行測定，同時測定單面針中水分、灰分、浸出物含量，建立單面針藥材的質量控制標準，以期為單面針藥效物質基礎研究和質量控制提供依據。

1 儀器與試藥

Waters e2695高效液相色譜系統，Empower工作站，含四元梯度泵、自動進樣器、紫外檢測器（Waters公司）；SQP型電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；P20-Y實驗室超純水機（湖南科爾頓水務有限公司）；KQ-500DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SZ-500A-3超高速多功能粉碎機（永康市善竹貿易有限公司）；SCAA-104（13 mm，0.22 μm）有機相針式濾器（上海安譜實驗科技股份有限公司）。

木蘭花堿對照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號M-026-170612，純度≥98%）。甲醇（德國Merck公司，色譜純），甲酸（天津市化學試劑研究所，分析純），水為超純水。單面針藥材分別購于廣西、廣東、湖南、湖北等地，兩面針藥材購于全國各大連鎖藥店、醫藥公司及藥材市場，經湖南中醫藥大學藥學院藥用植物教研室劉塔斯教授與中藥鑒定教研室龔力民副教授共同鑒定，分別為蕓香科花椒屬科植物蜆殼花椒Hemsley及兩面針（Roxb.）DC.的莖，樣品來源信息見表1、表2。

表1 單面針藥材樣品來源信息

編號產地收集日期 S1陜西省漢中市南郊區2016-03-06 S2陜西省榆林市青云鎮2016-03-08 S3陜西省安康市漢濱區2016-05-01 S4湖北省襄陽市保康縣2016-07-02 S5湖北省襄陽市樊城區2016-07-02 S6湖北省襄陽市南漳縣2016-07-02 S7四川省眉山市青神縣2017-01-01 S8四川省資陽市資中縣2017-02-03 S9廣西壯族自治區來賓市象州縣2017-04-02 S10廣西壯族自治區玉林市玉州區2016-11-17 S11廣東省陸豐市碣石鎮2016-11-17 S12廣東省廣州市海珠區2017-01-01 S13廣東省廣州市番禺區2016-08-17 S14廣東省廣州市天河區2016-08-17 S15湖南省吉首市雙塘鎮2016-08-19 S16湖南省吉首市丹青鎮2016-08-19 S17湖南省湘西土家族苗族自治州永順縣2016-05-01 S18湖南省張家界市永定區2016-05-01 S19廣東省廣州市南沙區2017-01-01 S20廣西壯族自治區南寧市江南區2016-11-17 S21湖南省吉首市河溪鎮2016-08-01 S22湖南省湘西土家族苗族自治州永順縣2016-08-01 S23廣西壯族自治區桂林市資源縣2016-11-17 S24湖南省湘西土家族苗族自治州花垣縣2017-06-01 S25湖南省湘西土家族苗族自治州瀘溪縣2017-06-01

表2 兩面針藥材樣品來源信息

編號來源產地收集日期 S26廣西玉林中藥材市場廣西玉林2016-02-01 S27湖南湘潭中藥材批發市場湖南湘潭2016-05-01 S28湖南千金藥材有限公司湖南株洲2016-05-01 S29湖南岳陽市養天和大藥房湖南岳陽2016-05-01 S30廣西賀州市大參林藥房廣西賀州2016-08-01 S31廣西藥材有限公司廣西南寧2016-08-01 S32湖南楚銘堂中藥有限公司湖南常德2016-05-01 S33廣東佛山臻誠中藥有限公司廣東佛山2016-11-01 S34廣東汕頭吉慶善養生堂藥店廣東汕頭2016-11-01 S35廣東廣州大參林藥房廣東廣州2016-11-01 S36廣東清遠老百姓大藥房廣東清遠2016-11-01 S37廣東珠海海王星辰連鎖藥店廣東珠海2016-11-01 S38湖南長沙千金大藥房湖南長沙2016-05-01 S39湖北心連心連鎖大藥房湖北荊州2016-07-01 S40安徽亳州藥材市場安徽亳州2016-08-01

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液

分別取25批單面針樣品和15批兩面針樣品，置真空干燥箱中，45 ℃干燥至恒重，粉碎，過40目篩，精密稱取樣品粉末0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇5 mL，密塞，稱定質量，浸泡12 h，超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）45 min，放冷，稱定質量，以70%甲醇補足減失的質量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.1.2 對照品溶液

精密稱取干燥至恒重的木蘭花堿對照品適量，置25 mL容量瓶中，加甲醇充分溶解，定容，制得濃度為1.6 mg/mL的木蘭花堿對照品溶液，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得木蘭花堿貯備液。

2.2 色譜條件

色譜柱為Athena C18，120A（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇-0.1%甲酸水為流動相，梯度洗脫（見表3），流速1 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長283 nm，進樣量10 μL。

表3 流動相梯度洗脫程序（%）

時間甲醇0.1%甲酸水 0 min694 12 min4060 14 min4060 25 min6535 30 min1000 35 min1000

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗

取同一批單面針樣品（S17），按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定，連續進樣6次，檢測指紋圖譜，木蘭花堿相對峰面積RSD＝1.22%，相對保留時間RSD＝0.47%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗

取同一批單面針樣品（S17）6份，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定，木蘭花堿峰面積RSD＝0.63%，表明方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗

取同一批單面針樣品（S17），按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h按“2.2”項下色譜條件測定，木蘭花堿峰面積RSD＝1.03%，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.3.4 線性關系考察

分別精密移取木蘭花堿貯備液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL，加甲醇稀釋定容至10、10、10、5、5、5 mL，得到濃度分別為0.048、0.096、0.144、0.384、0.480、0.576 mg/mL的系列對照品溶液，分別按“2.2”項下色譜條件進樣分析，以對照品濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，進行線性回歸，得回歸方程＝7.36×106＋4.38×104，＝1，木蘭花堿在0.48～5.76 μg范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.3.5 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的單面針樣品（S17）粉末0.5 g，共6份，分別精密加入0.48 mg/mL木蘭花堿對照品溶液0.5 mL，凍干樣品，再按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，過濾，按“2.2”項下色譜條件測定，計算平均回收率及RSD，結果木蘭花堿的平均加樣回收率為97.23%，RSD＝1.31%，見表4。

表4 木蘭花堿加樣回收率試驗

取樣量 /g樣品中含量 /mg加入量 /mg測得量 /mg回收率 /%平均回收率 /%RSD /% 0.501 51.362 90.240 01.600 098.7997.231.31 0.501 01.362 30.240 01.591 195.33 0.500 71.361 80.240 01.597 398.13 0.501 31.362 60.240 01.596 997.63 0.500 61.361 80.240 01.592 696.17 0.500 91.362 00.240 01.595 697.33

2.4 指紋圖譜建立

取25批單面針樣品和15批兩面針樣品，分別按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣分析。將色譜圖導入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2004A版），選定參照圖譜，時間漂移值為0.5，采用多點校正、平均數法對色譜峰自動匹配，分別得到25批單面針樣品（S1～S25）及15批兩面針樣品（S26～S40）的HPLC疊加圖譜，見圖1、圖2。同時生成單面針及兩面針對照圖譜，將二者對照圖譜進行比較，標示出共有峰及各自的特征峰，經對照品圖譜比對，指認其中保留時間12.3 min左右的3號峰為木蘭花堿，見圖3。可以看出，單面針和兩面針存在16個共有峰，且兩者具有各自的特征峰，單面針特有峰為a～d，兩面針特有峰為e～g。

圖1 25批單面針（S1～S25）HPLC疊加圖譜及其對照指紋圖譜

圖2 15批兩面針（S26～S40）HPLC疊加圖譜及其對照指紋圖譜

注：A.單面針；B.兩面針；C.木蘭花堿對照品

2.5 主成分分析

40批樣品指紋圖譜16個共有峰的原始數據不能體現出樣品之間的差異，故利用投影方法對原始數據進行標準化后，進行無監督的主成分分析（PCA）[14]。將原始數據導入SIMCA13.0軟件，分析結果見圖4。可見40批樣品有明顯區分趨勢，兩面針樣品居左側且較分散，單面針居右側并分為上下兩群，其中單面針中S25（湖南湘西瀘溪縣）與其他樣品差異較大，兩面針中S30（廣西賀州）與其他樣品差異較大。

圖4 40批樣品PCA得分圖

2.6 正交最小偏二乘-判別分析

正交最小偏二乘-判別分析（OPLS-DA）可以提高模型的有效性和解析能力，采用有監督情況下模式識別分析方法傾向于提取有利于樣本分類的變量信息，降低系統噪音的干擾，提高分類的效能[12]。將40批樣品指紋圖譜原始數據導入SIMCA13.0軟件，得到OPLS-DA得分圖（見圖5）。可以看出，單面針和兩面針明顯分為兩類，左側為單面針（S1～S25），右側為兩面針（S26～S40），且單面針樣品較集中，而兩面針樣品間差異較大。

圖5 40批樣品OPLS-DA得分圖

2.7 差異標記物篩選與鑒定

提取OPLS-DA模型中16個共有峰的變量重要性投影（VIP），結果見圖6。對16個共有峰峰面積VIP值從大到小進行排序，分析對單面針及兩面針分類具有顯著影響的成分。根據VIP＞1.0、＜0.05進行篩選，符合要求的有11個峰，表明其所代表的成分是引起單面針與兩面針差異的主要標志性成分。經與對照品比對，其中3號峰為木蘭花堿，其他化合物為未知物。因此，可以將木蘭花堿作為單面針區別于兩面針的指標性成分。

圖6 單面針和兩面針差異標志物VIP圖

2.8 樣品含量測定

精密取40批樣品粉末，按“2.1.1”項下方法制備，取供試品溶液及對照品溶液各2 μL，分別按“2.2”項下色譜條件進樣分析，記錄木蘭花堿峰面積積分值，代入回歸方程，計算樣品中木蘭花堿含量。每份樣品平行測定3次，結果見表5。采用SPSS21.0軟件對單面針和兩面針中木蘭花堿含量數據進行獨立樣本檢驗，結果表明差異有統計學意義（＜0.01）。結合差異標記物篩選及鑒定結果，木蘭花堿包含在差異性標志物中且差異較大，因此，可以將該成分作為區分單面針與兩面針的重要指標性成分。

表5 樣品中木蘭花堿含量測定結果（mg/g，n＝3）

編號木蘭花堿 編號木蘭花堿 編號木蘭花堿 S13.892 5 S152.451 1 S2915.844 8 S22.529 1 S162.529 1 S3021.027 2 S33.027 1 S172.723 0 S3110.855 6 S42.459 5 S184.038 7 S3211.603 2 S53.227 8 S192.768 6 S3319.905 8 S63.319 1 S202.824 0 S3417.990 1 S72.365 5 S212.295 0 S3516.820 9 S82.880 9 S222.476 5 S3610.455 2 S92.606 9 S232.453 1 S3718.948 3 S103.375 8 S242.345 9 S3816.822 6 S112.256 3 S252.885 9 S3918.208 8 S122.227 3 S2613.439 1 S4015.332 2 S133.485 8 S2716.858 9 S142.630 5 S2817.075 2

2.9 單面針樣品檢查項測定

取25批單面針樣品，粉碎，過2號篩，精密稱取2.0 g，按2015年版《中國藥典》（四部）通則0832測定水分。精密稱取單面針樣品粉末約4.0 g，按2015年版《中國藥典》（四部）通則2302測定總灰分和酸不溶性灰分。精密稱取單面針樣品粉末約4.0 g，分別以水和70%乙醇為浸出液，按2015年版《中國藥典》（四部）通則2201測定水浸出物和醇浸出物含量。每批平行測定3次，取平均值，結果見表6。25批單面針藥材的水分、總灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物、醇溶性浸出物的含量范圍分別為5.016%～10.910%、2.487%～5.973%、0.027%～0.147%、0.548%～2.512%、0.332%～2.113%，平均值分別為7.212%、4.230%、0.063%、1.716%、1.483%。因此，單面針中水分及總灰分含量規定可沿用原有地方標準，建議酸不溶性灰分含量不超過0.15%，浸出物含量不低于0.5%。

表6 單面針樣品檢查項測定結果（%，n＝3）

編號水分總灰分酸不溶性灰分水浸出物醇浸出物 S17.0464.3220.0961.9591.282 S25.7193.6710.0551.4011.255 S35.5894.1630.0401.1201.709 S46.5603.5080.0541.7271.709 S55.9604.0070.0781.5471.705 S65.7943.8700.0272.0061.474 S77.1704.6850.0542.0131.319 S85.0763.0880.0571.6711.267 S95.0163.0390.0531.4711.435 S105.9303.6320.0461.6811.368 S116.4244.7350.0712.1641.594 S126.0344.5610.1312.1101.873 S136.8564.9900.1471.9272.056 S146.5524.2210.0981.5482.033 S156.7845.9730.0282.2381.872 S166.5843.8900.0352.4361.701 S176.4814.7030.0772.1481.695 S187.1335.4840.0721.9771.650 S196.1865.3140.0382.5121.756 S209.6353.6310.0301.9321.235 S2110.2304.7030.0450.5480.332 S2210.3104.3220.0771.1510.364 S2310.9102.4870.0571.9592.113 S2410.3903.7470.0770.7201.526 S259.9235.0030.0280.9350.746 平均值7.2124.2300.0631.7161.483

3 討論

本試驗采用二極管陣列檢測器，對木蘭花堿對照品進行三維圖譜分析，結果表明木蘭花堿的最大吸收波長在283 nm處，為提高含量測定的檢測靈敏度，選擇283 nm作為檢測波長。

試驗流動相比較了有機相甲醇、乙腈及水相0.1%、0.5%甲酸水和冰醋酸水、磷酸水溶液，結果顯示，以甲醇-0.1%甲酸水為流動相時，樣品的分離達到要求。

為探討樣品提取的最優條件，本試驗考察了液料比（6∶1、8∶1、10∶1、12∶1）、提取溶劑（50%、70%、90%甲醇和乙醇）、超聲提取時間（30、45、60 min）對提取效果的影響。結果表明，溶劑為70%甲醇時木蘭花堿提取率較高，由于生物堿的極性較強，有機溶劑比例較低時不利于其溶解，故50%甲醇提取較差；液料比10∶1、超聲提取45 min條件下，色譜峰數目最多，峰面積較大，峰形較好。

本研究利用HPLC技術建立了不同產地單面針及兩面針的指紋圖譜，并對差異性成分木蘭花堿進行定性定量分析。本方法分析速度快，35 min即可完成，靈敏度高，分離效果佳，能顯示出樣品中各成分的信息，較直觀反映藥材質量。方法學考察結果表明，本方法重復性好，可操作性強，可用于單面針及兩面針藥材特征指紋圖譜的定性鑒別。結合二者共有生物堿含量測定結果，可確定單面針中化合物最低及最高限量，為單面針的含量測定提供依據。樣品含量測定結果表明，單面針樣品中S25（湖南省湘西州瀘溪縣）木蘭花堿含量最高。由于存在地域水土、氣候等影響因素，不同產地樣品在化學成分含量上存在差異，推測藥材生長于雨水較頻繁的地區可能導致其化學成分含量低于雨水較少的地區。本試驗收集的40批藥材采收時期、生長年份不同，可能導致藥材化學成分含量差異較大，很難僅憑某些成分或產地評價其質量。藥材生長因素和藥用部位對單面針化學成分的影響尚有待更多研究。

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Study on HPLC Fingerprint and Quality Standard of

LIU Qianqian1,2, LEI Simin1,2, HU Yuzhen1,2, XIA Bohou1,2, LIN Yan1,2, LIN Limei1,2,GONG Yun3, ZHANG Peng3, WU Ping1,2

To establish a quality-control method of, including establishment of characteristic fingerprint and determination of the contents of magnoflorine, moisture, total ash, acid insoluble ash and extract; To provide reference for distinguishingfrom.Fingerprints ofbased on HPLC method was established on a Waters Athena C18, 120A column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) at 30 ℃, with a gradient mobile phase composed of methanol and 0.1% formic acid at a flow rate of 0.3 mL/min. The detection wavelength was 283 nm. Principal component analysis and orthogonal partial least squares discriminate analysis were adopted to screen differential markers betweenand. The identification and determination of markers were carried out by comparing with real standard products. The contents of water, total ash, acid insoluble ash and extract were determined according to the general rule in four part of Chinese Pharmacopoeia (2015 edition).Characteristic fingerprints ofwere established. 11 mark compounds were found to distinguishand. Among which, magnoflorine was identified. The magnoflorine showed a good linear response in the range of 0.48?5.76 μg (=1). The average of recovery was 97.23% with RSD=1.31%. The contents of magnoflorine in the samples ofwere 2.227 3?21.027 2 mg/g, and the result of water, total ash, acid insoluble ash, water soluble extract and ethanol soluble extract ofwere 5.016%?10.910%, 2.487%?5.973%, 0.027%?0.147%, 0.548%?2.512% and 0.332%?2.113%, respectively.The established method is simple, accurate and reproducible, and can be used to evaluate the quality of.

; HPLC; quality standard; magnoflorine

R284.1

A

1005-5304(2020)10-0073-07

10.19879/j.cnki.1005-5304.201912463

國家中藥標準化項目（ZYBZH-C-HUN-21）；湖南省科技計劃（2015SK1001）；長沙市科技計劃（kq1706056、kq1804027）；湖南中醫藥大學“十三五”一級學科（2018年）

吳萍，E-mail：545371528@qq.com

（2019-12-27）

（2020-04-01；編輯：陳靜）