祖師麻片對CCI模型大鼠脊髓背角P2X4受體及p38 MAPK表達的影響△

宋敬怡，張天睿，馬丹，程龍，程文豪，李穎慧，張碩峰*，格桑頓珠

1.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 100029；2.西藏藏醫藥大學 藏藥系，西藏 拉薩 850000

祖師麻為瑞香科植物黃瑞香DaphnegiraldiiNitsche、陜西瑞香DaphnetanguticeMaxim.或凹葉瑞香DaphneretusaHemsl.的干燥莖皮及根皮。其味辛、苦，性溫；有小毒；歸肝經，具有祛風除濕、止痛散瘀的功效，其制劑祖師麻片收載于《中華人民共和國藥典》2015年版，臨床用于治療坐骨神經痛及風濕、類風濕性關節炎。

坐骨神經痛屬于神經病理性疼痛的一種。神經病理性疼痛的產生可導致神經系統對痛覺信號的產生、處理、傳遞等發生功能性障礙[1-2]。本研究采用慢性擠壓神經損傷(chronic constriction injury of the sciatic nerve model，CCI)誘導的坐骨神經損傷大鼠模型[3-4]，以痛反應時間(thermal withdrawal threshold，TWT)、50%機械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold，50% MWT)為指標，觀察祖師麻片對CCI模型大鼠神經病理性疼痛的抑制作用，并檢測CCI模型大鼠患側脊髓背角中絲裂原活化蛋白激酶p38(p38 MAPK)以及P2X4受體表達，以分析祖師麻片抑制坐骨神經痛的可能機制，為其在臨床的應用提供試驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物

6～7周齡SPF級SD大鼠84只(北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證編號分別為11400700192661、11400700193358、11400700202282)，雌雄各42只，體質量(200±20)g。大鼠飼養于北京中醫藥大學動物房，許可證號：SYXK(京)2016-0038，實驗過程中嚴格按照實驗動物使用的3R原則給予人道關懷。并獲得北京中醫藥大學實驗動物福利倫理委員會的批準(批準號：BUCM-4-2017090109-3009)。實驗前，大鼠適應性飼養3 d。

1.2 試劑

祖師麻片劑(秦皇島市山海關藥業有限責任公司，批號:20140702)，顏色為紅棕色，規格0.3 g/片，臨床人用量為每日3次，3片/次，即2.7 g·d-1，按照人體質量為75 kg進行計算，即36 mg·kg-1。確定大鼠受試劑量為0.432、0.216、0.108 g·kg-1，即常規用量的12、6、3倍量。布洛芬緩釋膠囊(天津中美史克制藥有限公司，批號:16080652)，規格4 mg/粒，常規用藥量為8 mg·kg-1·d-1，本實驗采用48 mg·kg-1作為陽性藥組大鼠的受試劑量，即常規用藥量的6倍。

兔抗P2X4多克隆抗體、兔抗p38 MAPK抗體(Proteitech公司)；DAB顯色劑、兔二抗超敏試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3 儀器

Von-Frey纖維毛(美國Stoelting公司)；冷/熱盤測痛儀(美國IITC公司)。

2 方法

2.1 分組及給藥

SD大鼠84只，雌雄兼用。結扎手術完成后第8天按TWT值運用對位隨機法分為7組，分別為對照組、模型組、假手術組、布洛芬組及祖師麻片0.432、0.216、0.108 g·kg-1組。

布洛芬組及祖師麻片各劑量組大鼠于術后1周(即第8天)開始灌胃給藥，每天給藥1次，共14次，對照組、模型組、假手術組大鼠給予相同質量的0.9%氯化鈉溶液。在造模后20 d測定相關行為學數據。

2.2 CCI模型的制備

除對照組外，其余各組大鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉麻醉，呈俯臥狀趴于手術臺上，右后肢外側褪毛處理。褪毛完成后將外側皮膚消毒后剪開，依次撥開皮膚、脂肪、淺筋膜直至看到股二頭肌，用眼科鑷將股二頭肌分離，用鑷子輕柔地將坐骨神經主干挑起，以相鄰結扎線的距離約為1 mm長度對坐骨神經進行結扎，共結扎4道。如大鼠大腿肌肉出現微微顫動，則說明結扎力度適宜[5]。結扎完畢之后將肌肉和皮膚逐層縫合，縫合處涂抹碘酒防止傷口感染。

2.3 指標檢測

2.3.1TWT測定 測定時間均設定在8：00～16：00。將大鼠放入透明玻璃罩內適應5 min，測量的開始時間為大鼠停止探覓行為。開啟冷/熱盤測痛儀，溫度調至55 ℃，測定時間上限30 s，觀察部位為患肢(即右后足)。當儀器加熱到指定溫度后，大鼠會因灼熱出現不停抬足或舔足現象，此時為時間記錄終點。記錄的時間長度應為自開啟儀器至大鼠右后足出現舔足反應所用的時間，每只大鼠測量3次，每次測量距離上次測量的時間超過10 min，痛反應時間為3次測量數據的平均值。

2.3.250% MWT的測定 測定時間均設定在8：00～16：00，室溫20～25 ℃，濕度46%～52%。將大鼠置于提前準備好的籠內，測量開始之前應使大鼠充分適應周圍環境，待其安靜后開始測量。利用Von-Frey纖維毛對其患肢(即右后足)進行刺激，方法為上下法，觀察大鼠患肢對Von-Frey纖維毛刺激出現的反應。選用的Von-Frey纖維毛質量分別為15、26、60、100、180、300 g，測量開始先用最小克數纖維毛對大鼠的患肢進行刺激，若大鼠對纖維毛產生蹬踹或縮足的變化記作O(陽性反應)，反之記作×(陰性反應)。當反應為O時，選取比當前用于測量的纖維毛質量低1級的纖維毛進行刺激，當反應為×時，選用比當前用于測量的纖維毛質量高1級的纖維毛刺激。當連續2個及2個以上性質相同的反應后出現與當前性質相反的反應時，此反應所對應的數值即為第1個正式數據，之后再測5個數據，則每只大鼠的正式數據共6個。查纖維毛換算系數表[6]并按照公式(1)計算50%引起陽性反應量(ED50)。

ED50=10loga+k×b

(1)

a：用于正式數據所對應的纖毛質量；b：相鄰纖毛的對數差的平均值；k：表中的相應參數。

2.3.3免疫組織化學反應顯色 末次給藥后1 h，大鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉麻醉，4%多聚甲醛溶液灌注，取出大鼠脊髓段L4～6后立即放入4%多聚甲醛溶液固定。脊髓段固定好后，經脫水、包埋處理后，每組隨機抽取較完整的6只大鼠脊髓組織進行切片，每張厚度為3 μm左右。切片脫蠟，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3 min×3；3%H2O2(15 min)封閉內源性過氧化物酶，PBS沖洗3 min×3；微波爐加熱20 min進行抗原修復；PBS洗3 min×3；加一抗在37 ℃溫箱孵育1 h，4 ℃過夜；次日取出，PBS洗3 min×3；加二抗孵育2 h，DAB顯色，放入水中充分洗滌；樹膠封片，觀察結果。

本實驗每只大鼠選取3張切片，于顯微鏡200倍的視野中觀察免疫組化法染色后脊髓中P2X4和 p38 MAPK的表達情況，光鏡下陽性表達區呈現棕褐色，每張切片隨機選取3個視野，完成后計算出各組別脊髓背角區域中陽性顯色的平均吸光度(A)。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 祖師麻片對CCI大鼠痛閾值的影響

結果顯示，大鼠結扎坐骨神經21 d后，患側痛閾值明顯降低，表現為TWT縮短，50% MWT降低(P<0.01)，提示模型大鼠患肢對溫度刺激、機械刺激敏感度提高，表現為痛覺過敏。與模型組比較，祖師麻片各劑量給藥后14 d，可明顯抑制大鼠患肢對溫度刺激、機械刺激敏感度的減低，表現為明顯延長TWT，提高50% MWT值(P<0.05，P<0.01)，結果見表1。

表1 祖師麻片對CCI大鼠痛閾值的影響

3.2 祖師麻片對CCI大鼠脊髓背角中p38 MAPK和P2X4受體表達的影響

造模21 d后，模型大鼠患側脊髓背角p38 MAPK、P2X4受體的表達水平明顯提高(與假手術組、對照組比較，P<0.01)。與模型組比較，祖師麻各劑量可不同程度抑制大鼠患側脊髓背角中p38 MAPK、P2X4受體表達水平的增高(P<0.01)，見表2和圖1～2。

表2 祖師麻片對CCI大鼠脊髓背角中p38 MAPK和P2X4受體表達的影響

注：A.對照組；B.假手術組；C.模型組；D.布洛芬組；E.祖師麻片0.108 g·kg-1組；F.祖師麻片0.216 g·kg-1組；G.祖師麻片0.432 g·kg-1組；下同。圖1 祖師麻片對CCI大鼠患側脊髓背角p38 MAPK表達的影響

圖2 祖師麻片對CCI大鼠患側脊髓背角中P2X4表達的影響

4 討論

神經病理性疼痛是神經系統受到機械損傷或炎癥侵害等引發的一種慢性疼痛，常導致痛覺的敏化，即痛覺過敏或觸痛超敏。CCI模型是臨床研究神經病理性疼痛常用的動物模型之一。本研究表明，在大鼠結扎坐骨神經1周后，其患肢對熱刺激、機械刺激敏感程度上升，具體表現為TWT縮短，50% MWT降低并隨著時間的推移有加重趨勢。提示結扎大鼠坐骨神經可導致其產生痛覺過敏，與坐骨神經痛的臨床癥狀一致。祖師麻為瑞香科植物，具有較強的抗炎、鎮痛作用[7-8]，其制劑廣泛用于類風濕、坐骨神經痛、跌打損傷等疾病的治療[9-10]，但深入研究較少。本研究結果表明，祖師麻片可明顯延長CCI模型大鼠患肢的TWT、提高50% MWT，顯現出較強的抑制痛覺敏感的作用，與文獻報道一致。

痛覺敏感是病理性疼痛的主要癥狀，而中樞敏化是產生痛覺敏感的主要機制。脊髓神經元的可塑性使神經細胞的興奮性升高及痛覺的傳導性提高，是痛覺中樞敏化的主要機制。MAPK在受體間的信號傳導過程中有著至關重要的作用，p38 MAPK作為MAPK家族中重要的信號通路之一，近年來受到了廣泛關注[11-12]。p38 MAPK廣泛存在于神經細胞和小膠質細胞中，可完成通路信息間的交流，可參與神經病理性疼痛的形成與維持。腺苷三磷酸(ATP adenosine triphosphate)是全身重要的供能物質，可以作為信號分子作用于小膠質細胞表面[13]。神經損傷產生后，小膠質細胞表面的P2X4受體上調[14]，使神經細胞p38 MAPK激活并表達增強，p38 MAPK激活后可提高神經元的興奮性，機體表現為疼痛感增強[15]。

本研究表明，CCI大鼠進行坐骨神經結扎后，脊髓背角的P2X4受體和p38 MAPK表達顯著性增多，與TWT、50% MWT的結果一致。布洛芬可抑制脊髓背角小膠質細胞表面的P2X4受體激活，患側脊髓背角p38 MAPK表達下調，阻斷中樞敏化的形成[6]，與實驗結果一致。祖師麻片可明顯抑制p38 MAPK和P2X4受體在CCI大鼠患側脊髓背角的表達，與給藥后模型大鼠的痛閾提高變化一致。提示祖師麻片可有效抑制CCI模型大鼠脊髓背角的P2X4受體上調，進而導致p38 MAPK的表達下降，使脊髓背角神經細胞的興奮性降低，調節痛覺信號傳導，疼痛反應減輕，這可能是祖師麻在脊髓水平發揮鎮痛作用的機制之一。

綜上所述，祖師麻片可抑制結扎大鼠坐骨神經所致的痛覺敏感，其機制與抑制脊髓患側背角中P2X4受體表達以及抑制p38 MAPK通路有關。