基于柱前衍生UPLC-MS/MS的寧陜地區豬苓單糖組成差異研究△

宋瑞琦，南鐵貴，張敏，胡開永，袁媛*

1.廣東藥科大學 中藥學院，廣東 廣州 510006；2.中國中醫科學院 中藥資源中心，北京 100700；3.湖北夢陽藥業股份有限公司，湖北 荊門 448124

豬苓為多孔菌科多孔菌屬豬苓Polyporusumbellatus(Pers.) Fries的干燥菌核[1]，是1種名貴的真菌類藥材，最早記載于《神農本草經》。豬苓的主要化學成分是多糖、甾體、氨基酸、蛋白質、維生素及微量元素等[2]。其中現代藥理研究表明，豬苓多糖為其主要活性成分，具有較好的抗腫瘤、延緩衰老、增強免疫和保護肝臟等作用，臨床療效明顯[3-4]。多糖為10個及以上的單糖通過糖苷鍵連接的高分子聚合物，多糖的單糖組成與其藥理活性密切相關。

目前，中藥材中單糖組分的研究已取得一定進展，不同種質、近緣種[5]、產區及生長時期[6-7]都可能導致藥材中單糖組成的差異。豬苓在我國分布廣泛，其主要產區包括陜西、四川、云南、吉林及黑龍江等地，陜西省安康市寧陜縣是豬苓的重要產區。近年來，豬苓多糖的研究僅限于提取工藝、含量測定、藥理活性等方面，而對豬苓多糖的組成、不同生長條件下豬苓中單糖組分的差異仍缺乏系統研究。本研究以寧陜縣所產豬苓為材料，利用柱前衍生化超高效液相色譜-質譜聯用技術比較了不同生長條件下豬苓多糖中單糖組成的差異，從而為調整優化寧陜地區豬苓種植結構提供技術支撐，也可為豬苓質量控制及進一步的藥理活性研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY UPLC I-Class系統(美國Waters公司，包括二元高壓梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器和柱溫箱)；QTRAP 6500型三重四極桿-線性離子阱質譜儀(美國AB Sciex公司，配有離子噴霧接口)；MS-S十萬分之一電子天平[梅特勒-托利多(上海)有限公司]；MM 400型球磨儀(Retsch公司)；Centrifuge 5415D型離心機(德國Eppendorf公司)；Pacific T-II型超純水儀(美國Thermo公司)；SB-800DTD型超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；D9145AZ型電熱干燥箱(上海恒科儀器有限公司)。

1.2 試藥

對照品D-果糖(Fruc，純度：99%)、D-甘露糖(Man，純度：98%)、D-阿洛糖(Allose，純度：98%)、D-半乳糖(Gal，純度：98%)、D-木糖(Xyl，純度：99%)、D-阿拉伯糖(Ara，純度：99%)、D-鼠李糖(Rha，純度：98%)、D-無水葡萄糖(Glu，純度：98%)、L-巖藻糖(Fuc，純度：98%)、D-核糖(Rib，純度：98%)、D-葡萄糖醛酸(GlcA，純度：98%)和D-半乳糖醛酸(GalA，純度：98%)購于上海源葉生物科技有限公司；蒽酮、硫酸、乙醇(色譜純，西隴化工股份有限公司)；甲醇和乙腈(色譜純，美國Merk公司)；三氟乙酸(TFA)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)購于Sigma公司；0.22 μm PTFE濾膜(天津津騰實驗設備有限公司)。

實驗材料為采自寧陜地區的34份豬苓菌核(見表1)，經統一干燥后作為分析樣品。研究樣品經中國中醫科學院中藥資源中心金艷副研究員鑒定為豬苓P.umbellatus(Pers.) Fries的菌核。

表1 豬苓樣品采集信息

2 方法

豬苓多糖中單糖組成采用本實驗室建立的高效液相色譜-點噴霧串聯三重四極桿質譜(UPLC-MS/MS)測定。經方法學考察12種單糖在各自范圍內線性關系良好(r>0.995)；精密度試驗結果RSD值<1.4%；重復性試驗RSD值<2.9%；穩定性試驗在0～24 h RSD值<5.0%；加樣回收率試驗中，平均加樣回收率為92.1%～105.6%，RSD<3.9%[8]。

2.1 豬苓多糖的的提取及衍生化產物制備

分別精密稱取12種單糖對照品各1.0 mg，制成質量濃度為1.0 g·L-1的儲備液，準確移取各儲備液100 μL，以超純水定容至2.0 mL，得到各單糖混合標準液。將12種單糖的混合標準溶液連續稀釋至質量濃度為0.01～1 000 μg·L-1。精密稱取豬苓粉末1.0 g，加入90 ℃去離子水15 mL，超聲提取30 min，離心取上清液，上清液加95%乙醇使乙醇最終濃度為80%，4 ℃醇沉12 h，再次離心后揮干乙醇，研細即得到豬苓多糖。精密稱取豬苓多糖1.0 mg，加入2.0 mol·L-1TFA 2.0 mL，110 ℃酸水解6 h，冷卻，真空冷凍干燥機內揮干TFA，加500 μL水復溶。精密吸取豬苓多糖的水解液及12種單糖的混合標準溶液各50 μL，與200 μL氨水溶液及200 μL 0.2 mol·L-1PMP甲醇溶液混和。混合物在70 ℃下反應30 min，冷凍干燥。以500 μL三氯甲烷洗滌2次，吸取水相，過0.22 μm微孔濾膜。其中豬苓單糖衍生化樣品稀釋100倍進樣[8]。

2.2 色譜條件

色譜柱：安捷倫ZORBAX RRHD Rclipse Plus C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動相：A為95%乙腈，B為25 mmol·L-1乙酸銨-5%乙腈，氨水調pH=8.2；梯度洗脫(0～7.0 min，13%A；7.0～9.0 min，13%～1%A；9.0～9.10 min，1%～12%A；9.10～12.00，12%A)；體積流量0.6 mL·min-1；柱溫35 ℃；進樣量1 μL[8]。

2.3 質譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；負離子模式；離子源溫度：500 ℃；多反應監測模式(MRM)進行定量分析；霧化氣GSI壓力：55.00 kPa；輔助氣GS2壓力：60.00 kPa。質譜參數見表2[8]。

3 結果與分析

3.1 不同生長年限豬苓多糖中單糖組成的差異

不同生長年限豬苓多糖中各單糖含量及比較見表3及圖1。2年生與3年生樣品中半乳糖、核糖、鼠李糖及巖藻糖的含量存在顯著性差異，其中2年生與3年生樣品半乳糖質量分數分別為10.30、1.17 mg·g-1，3年生樣品相較于2年生樣品半乳糖質量分數降低了88.6%；木糖質量分數分別為1.78、1.19 mg·g-1，3年生樣品相較于2年生樣品木糖質量分數降低了33.1%；鼠李糖質量分數分別為0.11、0.05 mg·g-1，3年生樣品相較于2年生樣品鼠李糖質量分數降低了54.5%；巖藻糖質量分數分別為0.96、0.34 mg·g-1，3年生樣品相較于2年生樣品巖藻糖質量分數降低了64.6%。2年生豬苓中單糖含量均一定程度高于3年生豬苓，但葡萄糖醛酸含量低于3年生。

表2 12種單糖類成分的質譜條件參數

表3 不同生長年限豬苓多糖中單糖質量分數 mg·g-1

注：與2年生豬苓樣品比較，*P<0.05。圖1 不同生長年限豬苓多糖中各單糖的含量比較

3.2 不同種植地勢豬苓單糖組成的差異

不同地勢種植地豬苓多糖中各單糖含量及比較見圖2及表4，供試平地與坡地種植地豬苓樣品中阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸及鼠李糖的含量存在顯著性差異。實驗結果表明，坡地種植樣品阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸及鼠李糖的質量分數分別為0.46、3.51、180.63、2.68、0.05 mg·g-1；平地種植樣品5種單糖的質量分數分別為0.25、1.56、88.70、0.56、0.03 mg·g-1。坡地種植豬苓可能有利于核糖、阿拉伯糖等8種單糖組分的積累而不利于半乳糖、巖藻糖的積累，這可能與豬苓喜山坡的生物學特性有關[9]。

注：與坡地種植豬苓樣品比較，*P<0.05。圖2 不同地勢種植豬苓多糖中各單糖的含量比較

3.3 翻窩與不翻窩豬苓單糖組成的差異

翻窩與不翻窩豬苓多糖中單糖含量及比較見表5及圖3，供試翻窩與不翻窩豬苓樣品中阿拉伯糖與葡萄糖含量存在顯著性差異。翻窩與不翻窩樣品阿拉伯糖質量分數分別為0.67、1.13 mg·g-1，不翻窩為翻窩的1.69倍；葡萄糖質量分數分別為187.17、367.21 mg·g-1，不翻窩為翻窩的1.96倍。此外，種植過程中不翻窩的豬苓樣品中各單糖的含量高于翻窩樣品，據此推測，種植過程中翻窩改變了豬苓生長環境從而影響了豬苓單糖的積累。

表4 不同種植地勢豬苓多糖中單糖質量分數 mg·g-1

表5 翻窩與不翻窩豬苓多糖中單糖質量分數 mg·g-1

注：與不翻窩豬苓樣品比較，*P<0.05。圖3 翻窩與不翻窩豬苓多糖中各單糖的含量比較

3.4 不同種植地點豬苓單糖組成的差異

寧陜地區不同種植地點豬苓多糖中單糖含量及比較見表6及圖4。江口鎮樣品與城關鎮樣品相比，阿拉伯糖、巖藻糖含量存在顯著性差異；江口鎮樣品與四畝地鎮樣品相比，阿拉伯糖、半乳糖、核糖、鼠李糖、巖藻糖、果糖和葡萄糖含量具有顯著性差異；城關鎮與四畝地鎮樣品相比僅半乳糖含量存在顯著性差異。江口鎮、城關鎮及四畝地鎮3地樣品阿拉伯糖質量分數分別為1.13、0.67、0.46 mg·g-1，江口鎮為城關鎮的1.68倍，為四畝地鎮的2.49倍；半乳糖質量分數分別為8.00、8.30、1.12 mg·g-1，江口鎮為四畝地鎮的6.86倍，城關鎮為四畝地鎮的7.12倍；果糖質量分數分別為4.55、4.19、1.88 mg·g-1，江口鎮為四畝地鎮的2.41倍；核糖質量分數分別為0.68、0.45、0.27 mg·g-1，江口鎮為四畝地鎮的2.53倍；葡萄糖質量分數分別為367.21、217.51、180.63 mg·g-1，江口鎮為城關鎮的1.69倍，為四畝地鎮的2.03倍；鼠李糖質量分數分別為72.25、74.87、46.08 μg·g-1，江口鎮為四畝地鎮的1.52倍；巖藻糖質量分數分別為0.77、0.70、0.34 mg·g-1，江口鎮為城關鎮的1.1倍，為四畝地鎮的2.24倍。此外，江口鎮豬苓多糖中各單糖含量均高于四畝地鎮。

表6 不同種植地點豬苓多糖中單糖質量分數 mg·g-1

注：與江口鎮樣品比較，*P<0.05，**P<0.01；與城關鎮樣品比較，##P<0.01。圖4 不同種植地點豬苓多糖中各單糖的含量比較

3.5 灰苓與黑苓中單糖組成的差異

灰苓與黑苓多糖中單糖含量及比較見表7及圖5，實驗選取了江口鎮與四畝地鎮2個地點的灰苓與黑苓進行了單糖含量比較，結果發現江口鎮黑苓與灰苓多糖中葡萄糖含量及鼠李糖含量存在顯著性差異，其中葡萄糖質量分數分別為367.21、195.61 mg·g-1，黑苓為灰苓的1.88倍；鼠李糖質量分數分別為72.25、49.46 μg·g-1，黑苓為灰苓的1.4倍。四畝地鎮黑苓與灰苓中阿拉伯糖、葡萄糖的含量存在顯著性差異，其中阿拉伯糖質量分數分別為0.46、0.23 mg·g-1，黑苓為灰苓的2倍；葡萄糖質量分數分別為180.63、91.99 mg·g-1，黑苓為灰苓的1.96倍。此外，結合兩地單糖含量測定結果發現黑苓中阿拉伯糖、甘露糖、木糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸及巖藻糖的含量高于灰苓，而半乳糖、核糖含量則低于灰苓。在豬苓由灰苓時期向黑苓時期轉變過程中可能有利于阿拉伯糖等6種單糖的積累，同時半乳糖與核糖有一定的消耗。

表7 灰苓與黑苓多糖中單糖質量分數 mg·g-1

注：與同產地黑苓比較，*P<0.05，**P<0.01。圖5 灰苓與黑苓多糖中各單糖的含量比較

4 結論與討論

本實驗采用UPLC-MS/MS的方法對寧陜地區豬苓單糖組成進行檢測。通過與標準品單糖衍生物對比，發現寧陜地區豬苓多糖主要由阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、核糖、木糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖及巖藻糖10種單糖組成，其中葡萄糖所占比例最高。

不同生長年限、不同種植地勢、種植過程中是否翻窩、不同種植地點及不同生長時期的豬苓多糖中單糖組成均存在一定的差異。種植過程中翻窩會一定程度降低豬苓中各單糖含量，且阿拉伯糖與葡萄糖含量也發生顯著性變化。因此，在豬苓栽培過程中應避免翻窩。除半乳糖、巖藻糖外，其他8種單糖在坡地種植豬苓中的含量均高于平地，這與豬苓喜山坡的生物學特性相吻合[9]。2年生豬苓中半乳糖、核糖、鼠李糖及巖藻糖含量均顯著高于3年生豬苓，在2～5年生豬苓中多糖含量并非逐年增加[10]，推測豬苓在不同的生長時期對糖類成分的消耗可能存在差異，但其中機制仍待進一步研究。通過比較灰苓與黑苓單糖組分，發現江口鎮二者的葡萄糖與鼠李糖含量存在顯著性差異，而四畝地鎮則為葡萄糖與阿拉伯糖含量存在顯著性差異。不同種植環境黑苓的單糖組成及含量分析存在一定差異，提示不同種植環境會對豬苓單糖積累產生影響。

在豬苓栽培過程中，發育時期、生長年限、種植地點、種植地勢及栽培中是否翻窩對豬苓中單糖組分的含量均造成一定的影響，其中不同種植地點對各單糖組分含量的影響最為明顯。因此，進一步研究豬苓中單糖的組分及其變異規律并探究其與產地及指標性成分之間的相關性，可為豬苓種植地區的確定、具體栽培措施的制定、藥材產量與質量的提升及品種選育提供一定的理論依據。