基于網絡藥理學與分子對接探討木瓜治療膝骨關節炎的分子機制△

時孝晴，梅偉，茆軍，張農山，邢潤麟，殷松江，王培民

南京中醫藥大學附屬醫院/江蘇省中醫院，江蘇 南京 210029

膝骨關節炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種中老年常見、多發疾病。伴隨全球人口老齡化的不斷發展，KOA的發病率逐年遞增，逐漸成為全球范圍內的公共健康挑戰[1]。多數KOA患者臨床表現為關節酸痛不適，當疾病進一步進展時，患者膝部常疼痛難忍，嚴重影響其生活質量，甚至最終導致殘疾。木瓜為薔薇科植物貼梗海棠Chaenomelesspeciosa(Sweet) Nakai的干燥近成熟果實，性味酸、溫，歸肝、脾二經，主要用于濕痹拘攣、腰膝關節酸重疼痛、吐瀉轉筋、腳氣水腫等?！度沼帽静荨酚涊d：“木瓜治腳氣上攻，腿膝疼痛，止渴消腫”?！妒朝煴静荨芬嘤涊d：“煮木瓜令爛，研作漿粥樣，用裹痛處，冷即易，一宿三、五度，熱裹便差。煮木瓜時，入一半酒同煮之，治腳膝筋急痛”。《本事方》中記載：“木瓜煎可治筋急項強，不可轉側”。在臨床運用木瓜時，雖不將木瓜作君藥使用，但以木瓜為臣、為佐，常起到良效。正如《本草新編》曰：“木瓜，但可臣、佐、使，而不可以為君，乃入肝益筋之品，養血衛腳之味，最宜與參、術同施，歸、熟(地)并用”。木瓜治療KOA療效確切，但其具體作用機制尚不清楚。

隨著現代藥理學、計算機學、分子生物學、生物信息學的迅速發展，網絡藥理學逐漸成為一種新型疾病-藥物預測模式[2]。其在“藥物-靶點-疾病”的理論框架下，深度挖掘藥物數據庫、疾病數據庫、基因數據庫等，并以網絡圖的形式進行展示，借以闡釋復雜的藥物如何作用于人體。中藥具有多成分、多靶點、多通道的復雜特點，這一特征與網絡藥理學的整體性、系統性相一致。近年來，通過網絡藥理學研究中藥的作用機制取得了巨大進步，成為探索中醫藥治療疾病具體靶點與通路的有力工具。故本研究借助網絡藥理學，探索木瓜的靶點、通路以及藥物有效成分之間的互作關系，為其治療KOA提供機制理論支撐。

1 資料與方法

1.1 化合物成分收集與篩選

在中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)中檢索木瓜的中藥化學成分信息，其篩選條件設置為藥物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，藥物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18，獲取藥物活性成分[3-4]。

1.2 木瓜及KOA相關作用靶點獲取

以“knee osteoarthritis”作為關鍵詞，通過GeneCards(https：//www.genecards.org/)與OMIM(https：//www.omim.org/)數據庫，檢索并篩選與KOA相關的作用基因。通過UniProt數據庫(https：//www. uniprot.org/uniprot/)將2.1項中所獲得的藥物作用靶標轉化為與GeneCard數據庫相匹配的基因名稱(gene name)。最后，將木瓜活性成分的靶點預測結果和KOA相關靶標的檢索結果進行匹配，并選擇重疊靶點作為木瓜治療KOA的核心靶點。利用Venny 2.1(http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線工具進行木瓜活性成分靶點和KOA靶點的映射并繪制韋恩圖。

1.3 藥物活性成分與疾病作用靶點網絡構建

將木瓜的活性成分和KOA相關靶點篩選結果導入Cytoscape Version 3.7.1軟件[5]，構建木瓜活性成分與KOA靶點網絡。其網絡的節點(node)表示靶點或活性成分，邊(edge)表示其相互作用。Cytoscape軟件的核心架構是網絡，每個節點是基因、蛋白質或分子，節點與節點之間的連接代表這些生物分子之間的相互作用。節點的度值(degree)代表網絡中節點與節點相連的數目，度值越大，這個靶點越有可能成為化合物的關鍵作用靶點。

1.4 蛋白-蛋白相互作用(PPI)網絡構建與核心基因篩選

String數據庫(https：//string-db.org/)收集了大量蛋白相互作用關系，并給出了數據置信范圍(低置信度：<0.4；中等置信度：0.4～0.7；高等置信度：>0.7)。在此基礎上，將木瓜的蛋白靶點導入STRING數據庫，物種限定Homo sapiens，置信度為0.7，進行PPI網絡分析，繪制PPI網絡圖。將該圖導入Cytoscape version 3.7.1軟件進行拓撲屬性分析。借助“Network analyzer”功能，計算參與互作靶蛋白的度值和介數(betweenness)。PPI網絡連線的粗細代表互相作用的強弱，靶點的度值反映了1個節點與其他節點的連接數目，度值越大代表此節點與其他節點的關系更緊密，在網絡中地位越重要。對度值按降序進行排序，篩選出序號前20的靶點為關鍵靶點，借助R project軟件繪制條形圖，顯示基因名與其連接節點數目。

1.5 GO與KEGG富集分析

使用半編程性質的腳本性軟件R project，可實現多種生物信息分析與結果可視化。先利用RGUI及org.Hs.eg.db獲取核心靶點的entrezID，然后利用RGUI、DOSE及ClusterProfiler對核心靶點進行GO功能富集(molecular function，MF；biological process，BP；cellular component，CC)及KEGG通路進行富集。在程序語言中，將Pvalue Cutoff=0.05，Qvalue Cutoff=0.05，分析結果選擇富集程度最高的前20條，選擇氣泡圖的形式予以展示。最后利用R project軟件及pathview，通過KEGG數據庫(KEGG，https：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html)下載富集排名前20名通路。通過人工查閱相關文獻及反復對比篩選后，最終納入結果。

1.6 分子對接

Discovery Studio 2016 3.0是一個新一代分子建模和模擬環境，應用于蛋白質結構功能研究以及藥物發現。采用Discovery Studio 2016 3.0對蛋白相互作用網絡中度值靠前的3個靶點與木瓜藥效成分進行分子對接驗證。保存分子對接結果，并對其LibDock score進行分析，用以評價木瓜活性成分與靶點之間的結合活性。并用臨床上廣泛應用于治療KOA的陽性藥物塞來昔布(celecoxib)進行對照分析。

1.6.1活性成分與KOA作用靶點晶體的獲取 通過活性成分與疾病作用靶點網絡構建，得到木瓜的類藥成分與KOA作用靶標。上述類藥成分、塞來昔布(陽性對照藥物)的mol2結構和KOA相關靶點的蛋白質晶體結構，分別通過Chemical Book數據庫(https：//www.chemicalbook.com/)、RCSB PDB數據庫(https：//www.rcsb.org/)下載。

1.6.2對接步驟及結果評價 將1.6.1得到的結果依次導入Discovery Studio 2016 3.0軟件，進行預處理。首先對每個類藥成分進行Prepare Ligands，參數為默認值，保存為分子對接配體。其次通過Prepare Protein，參數取默認值，得到預處理蛋白質結構，抽離靶點原配體，保存為分子對接受體。受體活性位點選擇原配體抽離位置，在LibDock模塊設定Docking Preferences為High Quality，對接匹配方法(Conformation Method)為BEST，Parallel Processing為True，其他參數取默認值。對接結果以打分函數LibDock score給出，LibDock score越高，預測成分與靶點結合的活性越高。

2 結果

2.1 木瓜活性成分的篩選

檢索TCMSP數據庫，篩選條件為OB≥30%、DL≥0.18，共檢索到木瓜中包含4個活性成分，對4個活性成分進行手工檢索相關靶點，最終納入3個有效活性成分,包括槲皮素、白樺脂酸、表兒茶酸，見表1。

表1 TCMSP中木瓜的活性成分

2.2 木瓜活性成分靶點庫與KOA作用靶點集的構建

檢索TCMSP數據庫中成分靶點，其收錄的木瓜中成分作用靶點共162個。使用Uniprot數據庫收集作用靶點的基因名(gene name)，刪除無效與重復的靶點，最后得到78個活性成分作用靶標。通過GeneCards、OMIM數據庫檢索整合得到1543個KOA相關基因靶點。將78個活性藥物靶點與1543個KOA相關靶點基因進行映射，得到44個共同靶點基因，韋恩圖見圖1，具體藥物活性成分靶標見表2。

圖1 KOA靶點與木瓜成分靶點韋恩圖

表2 木瓜治療KOA潛在靶標信息

2.3 構建“藥物-成分-疾病-靶點”網絡

將3種藥物活性成分和44個疾病相關作用靶點篩選結果進行映射，去除無對應靶點的化學成分，并刪除重復的靶點。將數據導入Cytoscape 3.7.1軟件，構建藥物靶點-疾病靶點交集網絡，見圖2。由圖2可得，此網絡共包括節點50個，邊93個。木瓜的1種活性成分可對應1個或多個疾病靶標，多種藥物活性成分可對應相同的疾病靶標，提示木瓜治療KOA具有多成分、多靶標的特點。

注：綠色橢圓形代表中藥名稱；紫色八邊型代表疾病名稱；青色三角形代表藥物有效成分；藍色四邊形代表疾病作用靶標。圖2 中藥化合物-靶點網絡

2.4 PPI網絡分析

將木瓜可能治療KOA的44個關鍵靶標導入STRING數據庫，獲取其相互作用關系并保存PPI網絡圖與TSV格式文件，見圖3。PPI網絡中共包含節點44個，邊122條。充分體現了中藥治療疾病作用機制的復雜性。在PPI網絡中，度值較高即處于較為核心位置的靶點包括VEGFA、IL6、ESR1、CASP3等。利用R軟件繪制條形圖，展示了PPI網絡中度值中心性較高的前20位的靶點，見圖4。

圖3 木瓜治療KOA潛在作用靶點間的PPI網絡

圖4 PPI網絡中排名前20的關鍵靶點

2.5 GO和KEGG通路富集分析

分析44個核心靶點主要富集的分子功能、生物過程、細胞成分。結果顯示，木瓜治療KOA的核心靶點共在65個GO term上富集。其中所涉及的生物學功能與過程主要包括RNA聚合酶II轉錄調節區序列特異性DNA結合轉錄因子活性參與轉錄的正調節、蛋白質異二聚化活性、RNA聚合酶II核心啟動子近端區序列特異性DNA結合、核心啟動子近端區序列特異性DNA結合、染色質結合、配體激活的序列特異性DNA結合RNA聚合酶II轉錄因子活性等，與細胞增殖、細胞凋亡及調控細胞代謝等生物學過程密切相關。以P<0.05為閾值篩選排名前20的GO分析結果，見圖5。對木瓜治療KOA的44個核心靶點進行KEGG富集分析，分析結果顯示，共富集在83條通路上，其中與KOA通路相關的主要包括細胞凋亡、PI3K-Akt、腫瘤壞死因子(TNF)、核轉錄因子-κB(NF-κB)以及p53信號通路等。這些經典信號通路對KOA的發生、發展起到重要作用。以P<0.05為閾值篩選排名前20的KEGG分析結果，見圖6。GO和KEGG分析提示木瓜可以通過以上多條通路作用于KOA。

圖5 木瓜活性成分潛在治療KOA靶點的GO功能分析

圖6 木瓜活性成分潛在治療KOA靶點的KEGG富集分析

2.6 靶點通路分析

利用KEGG Mapper工具獲取木瓜治療KOA的通路圖(見圖7)。木瓜與KOA相關靶點標記為紅色。細胞凋亡通路圖顯示，木瓜治療KOA涉及12個效應靶點。

2.7 分子對接分析

Discovery Studio分子對接驗證網絡藥理學。LibDock score代表分子對接吻合度，分數越高代表配體與受體蛋白結合性越好。分子對接結果表明，木瓜活性成分與KOA部分關鍵靶點蛋白分子對接吻合度較好。木瓜活性成分與塞來昔布相比，分子對接吻合度無明顯差異。與此同時，也間接驗證了木瓜對于KOA的VEGFA、IL6、ESR1等靶點具有調節作用。分子對接結果與網絡藥理學篩選結果一致，用分子對接的方式驗證了網絡藥理學的可靠性。木瓜成分配體與KOA靶蛋白受體的對接結果見表3，對接過程見圖8。

注：紅色表示木瓜治療KOA靶點。圖7 木瓜在細胞凋亡通路中的作用靶點

表3 配體受體蛋白分子對接的結果

注：A.IL6與塞來昔布對接過程；B.IL6與表兒茶酸對接過程；C.VEGFA與表兒茶酸對接過程；D.VEGFA與塞來昔布對接過程；E.ESR1與槲皮素對接過程；F.ESR1與塞來昔布對接過程。圖8 木瓜活性成分、塞來昔布和KOA相關靶點的部分對接過程

3 討論

KOA是一種慢性關節退變性疾病，其主要表現在于關節軟骨退化、關節邊緣和軟骨下骨的反應性增生[6]。流行病學調查發現，60歲以上人群當中，全球KOA患病率達10%以上，而中國農村人群中其患病率超過16%，給患者、家庭及社會帶來了較為沉重的經濟壓力[7]?，F在臨床常用于治療KOA的藥物，如非甾體抗炎藥(NSAID)，存在消化系統、心血管系統等不良反應。與此同時，葡萄糖胺和軟骨素等軟骨保護劑與安慰劑組相比，亦沒有顯著的臨床益處[8]。中醫中藥的簡、便、廉、效及其較小的不良反應等優勢逐漸凸顯。

祖國傳統醫學認為KOA屬于“痹癥”范疇。木瓜具有舒筋活絡、和胃化濕的功效，可用于治療濕痹拘攣、腰膝關節酸重疼痛。木瓜治療KOA療效顯著，但更為確切的治療靶點、通路不清，缺乏相關分子層面的研究。KOA-木瓜靶點基因網絡揭示，引起KOA的靶點眾多，且靶點之間存在著復雜的作用關系，并非單一靶點起作用。中藥治療KOA具有多成分、多靶點的特點，采用網絡藥理學分析有利于從分子水平闡明其作用機制。

通過檢索數據庫并設置篩選條件，最終得到3個有效活性成分，包括槲皮素、白樺脂酸與表兒茶酸?，F代研究發現，槲皮素具有抑制膝關節中軟骨細胞凋亡、減弱氧化應激反應、抑制軟骨細胞外基質降解的作用[9-12]。表兒茶酸對成骨細胞具有雙向調節作用，在中低濃度時可促進成骨細胞增殖，高濃度時對其產生抑制作用[13]。白樺脂酸呈劑量依賴性的抑制了白細胞介素-1β(IL-1β)誘導的基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)、MMP-3、MMP-13、前列腺素E2(PGE2)和一氧化氮(NO)生成，其可能是通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)來抑制IL-1β誘導的KOA[14]。

此項研究通過木瓜靶點與KOA靶點構建網絡，基于節點的度值，對包括VEGFA、IL6、ESR1、CASP3、CCND1等排名前20的關鍵靶點進行了排序。KEGG通路富集與靶點通路分析顯示，KOA發生機制與相關靶點及其所分布的通路有密切關聯。這與目前對上述中藥活性成分及其關鍵靶點的研究結果和其與KOA間關系的相關研究基本一致。

VEGFA是血管內皮生長因子(VEGF)家族的成員，其表達水平降低可以增強軟骨形成和預防骨關節炎的疾病進展[15]。其原因可能由apelin介導的滑膜VEGF參與了KOA的疼痛通路[16]。同時研究表明，抑制VEGF不僅可以增強軟骨細胞分化，還可以保護軟骨細胞免受TNF-α誘導的軟骨細胞中細胞外調節蛋白激酶1/2(ERK1/2)的磷酸化[17]。IL-6是一種強烈激活免疫系統并增強炎癥反應的細胞因子，其參與各種炎性疾病的發病過程。對IL-6進行抑制，一方面減少了碘乙酸單鈉誘導的骨關節炎(OA)大鼠實驗模型的疼痛行為，另一方面，通過阻斷IL-6或信號傳導及轉錄激活蛋白-3(STAT-3)，可以減輕內側半月板失穩造成的OA大鼠的疼痛癥狀[18]。ESR1屬于配體調控轉錄因子的核受體(NR)超家族，可表達于成骨細胞、破骨細胞、軟骨細胞以及骨細胞，軟骨細胞中E2靶向活化ESR1，通過抑制ERK磷酸化激活，進而抑制ERK信號通路，促進自噬流的形成，激活自噬，減少凋亡，進而引起軟骨細胞的增殖[19-20]。Meta分析及基因相關性研究同樣顯示，ESR1基因與KOA具有相關性[21-22]。CASP3是細胞凋亡過程中的關鍵酶。Takada等[23]發現,OA的病理進展與細胞凋亡與內質網應激反應有關，CASP3活化與軟骨退變、軟骨細胞凋亡具有相關性。在KOA人群中CCND1的表達下調，且隨著KOA嚴重程度的增加，其下調越多。當CCND1過表達時，其可以逆轉FOXD2-AS1抑制對軟骨細胞活力的影響[24-25]。

根據GO注釋結果可知，木瓜主要通過影響關節軟骨代謝、生長和修復，細胞增殖、分化、凋亡和抵抗氧化應激、炎癥等通路而發揮治療KOA的作用。通過KEGG富集分析，其結果主要富集在細胞凋亡、TNF、NF-κB、p53、AGE-RAGE等信號通路。

細胞凋亡是細胞的一種程序化死亡?，F代研究發現，調控KOA軟骨細胞凋亡的信號通路復雜多樣，如PI3k/Akt信號通路、MAPK信號通路、MAPK/JNK信號通路、MAPK/ERK1/2信號通路、TLR4信號通路等[26-28]。p53是一種轉錄調節因子，在細胞凋亡的啟動中發揮重要作用，當發生物理損傷、缺氧、代謝異常時可引起p53的過度表達，過度表達的p53能夠刺激Bax基因表達增加，使Bax和Bcl-2的比例失調，從而促進細胞凋亡[29]。在凋亡信號轉導的級聯反應中，過度表達的p53作用于線粒體，使其膜電位以及通透性改變，釋放細胞色素C，從而激活Caspase-3，亦引起細胞凋亡的發生[30]。TNF-α是促炎細胞因子的一種，其在炎癥過程中發揮重要作用[31]。TNF-α誘導產生MMP，包括MMP-1、MMP-3、MMP-13及ADAMTS-5等[32]。同時TNF-α能夠激活NF-κB信號通路，使得TNF-α的促炎功能進一步加強[33]。?zler等[34]發現，在晚期KOA患者的血清與膝關節滑液中的TNF-α升高與疾病等級呈正相關。隨著疾病嚴重程度的進展，滑液MMP-13和血清TNF-α水平明顯增加，但TNF-α水平是一種全身性升高，MMP-13水平則在局部升高。在關節炎組織中，NF-κB信號傳導途徑可以被促炎細胞因子、機械應激和細胞外基質降解產物激活，這種活化可以調節許多細胞因子、炎癥介質、轉錄因子和幾種基質降解酶的表達[35]。在KOA的病理進展中，其被KOA軟骨細胞活化。NF-κB信號通路不僅與促炎、應激等相關，而且該通路的激活可促進軟骨細胞分化為肥大樣狀態[36]。持續的NF-κB活化可誘導ELF3、HIF2、RUNX2等轉錄因子，進而引發MMP-13和ADAMTS5蛋白酶的產生，其促進關節軟骨細胞從前肥大狀態轉變為終末分化肥大狀態[36]。

綜上所述，本研究采用網絡藥理學方法和技術，篩選出木瓜中3種藥物活性成分和81個潛在治療靶點。共有1543個KOA疾病相關靶標，其中44個是木瓜-KOA的共同靶標。通過對GO生物過程和KEGG信號通路的富集分析，初步預測木瓜可能通過槲皮素、白樺脂酸、表兒茶酸等有效活性成分調控VEGFA、IL6、ESR1、CASP3、CCND1等靶點，調節細胞凋亡、TNF、p53、NF-κB、AGE-RAGE等信號通路，最終抑制炎癥反應，調節免疫功能，干預細胞凋亡過程，從而治療KOA。網絡藥理學的分析結果一方面說明了引起KOA因素多且復雜，另一方面也直觀的表明了木瓜多成分、多途徑、多靶點治療KOA的特點，研究結果有助于對KOA發病機制的理解，并在預防和治療KOA方面拓展了新的治療策略。但由于數據庫、相應的分析算法和各種平臺的軟件功能的局限性，其結果可作為開展實驗研究的線索，但具體機制有待實驗研究進一步驗證。