中醫“芳香辟穢”理論指導下芳香精油在農業生態種植中的應用潛力△

董鮮，李晴晴，霍瑩瑩，陳傳嬌，曾子盈，2，段素素，2，馬玉楠，程永現，2*

1.云南中醫藥大學 中藥學院，云南 昆明 650500；2.深圳大學 醫學部藥學院，廣東 深圳 518060

植物與動物不同，動物當面臨不利環境時可以直接逃走，也正因此，植物進化出獨特的防御策略，以應對不良環境對其造成的威脅。對于植物來說，為了彌補其的不動性，能與生物環境相互作用，形成了不同的防御機制[1]，包括主動和被動防御機制[2]。植物為保護自己免受食草動物和病原體的侵害，能產生大量的次生化學物質，其中一些化學物質一直被用于病蟲害防治[3]。植物形成的“抗生素”得到最多關注的是植保素[4]。

植物病害嚴重威脅著農業的良性發展。在現代農業生產中，為保證栽培作物的產量，大量化學殺菌劑的施用已成一種常規[5]。雖然短期內能提高經濟效益，但由此引發的更為嚴重的問題不可忽視，如：土壤污染、農藥殘留、致病菌抗性增強、新的突變菌株產生、有益微生物被毒殺、微生態失衡等。盡管公眾普遍關注合成農藥對健康和環境的長期影響，但由于天然生物農藥生產成本高、開發周期長等瓶頸問題，其尚未在市場上占據較大份額。植物源殺菌劑的毒性和殘留量都很低，對環境、動物和人類大多是友好的。植物源農藥由植物在脅迫環境中不斷進化所產生的化學物質組成，可用于防御病原微生物[6]。其中，揮發性有機化合物的釋放自1980年以來一直受到關注[7]。植物揮發油是植物次生代謝中有氣味、易揮發的產物，廣泛應用于傳統醫藥、食品調味保鮮劑、香料工業和農業[8]。揮發油從天然植物和香料中提取出來，以其良好的抗菌和抗氧化性能而聞名，也因其揮發性而不會產生任何殘留效應而引起關注[9]。本研究就揮發油的植物資源、抗菌活性、活性成分、可能的抗微生物機制及其在農業領域中的應用作一綜述。

1 植物資源

大多數揮發油廣泛存在于各種芳香植物中。到目前為止，已經確認了近3000種揮發油，其中300種具有重要商業價值，特別是在制藥、農藝、食品、衛生、化妝品和香水行業[10]。我國約有56科136屬300種芳香植物，主要分布于溫帶至中溫帶，特別分布于菊科、柳科、烏梅科、唇形科、姜科、樟科、木蘭科、馬兜鈴科、馬鞭科、禾本科、纈草科等科中[11]。揮發油可以由所有植物器官，即芽、花、葉、莖、枝、種子、果實、根、木材或樹皮合成，并儲存在分泌細胞、表皮細胞或腺毛等植物組織中。揮發油含量在植物中一般小于1%，少數在10%以上。其含量隨植物種類、植物器官或生長階段的不同而變化。由于分析方法和設備的限制，多數研究對植物揮發油的化學成分只進行了鑒定。隨著毛細管氣相色譜的應用和完善，可以識別出數十種甚至數百種化學物質，這將有利于香料資源的深入開發和尋找，也有利于優良芳香植物品種的選育。從植物中提取揮發油的方法有多種，目前主要采用沸水或水蒸汽蒸餾法、冷壓萃取法、液體二氧化碳法或微波法[10]。采用水蒸氣蒸餾法和超臨界流體萃取法，揮發油的提取率和純度均高于其他方法。

2 揮發油抗菌活性及其主要活性成分

揮發油的抗菌價值在于其所具有的生物活性成分及其對病原菌的特殊作用機制。對各種揮發油的化學成分初步定性研究表明，其存在醇、醛、酮和酚類等化合物[11]，含量可能因季節或存在部位而異[12]。這些揮發性化合物被認為是“綠色農藥”概念的一部分，是有利于環境保護的天然抗菌物質[13]。據報道，揮發油的抑菌活性成分一般由1，8-桉葉酚、香茅醛、香茅醇、乙酸香茅酯、檸檬烯、芳樟醇、β-蒎烯、γ-松油烯、α-松油醇和芳香烴等組分組成。芳香植物中的主要生物活性成分被認為是次生代謝物的組合[14]。多種揮發油都具有抗氧化、抗真菌、抗毒素等活性，可用于抑制農產品變質所涉及的病原菌，并可作為合成化學品的生態替代物，用于治療多種細菌和真菌病害。此外，揮發油也被認為是一種有效的消除玉米烯酮(1種鐮刀菌毒素)污染和/或解毒的手段[13]。

筆者就具有農用抑菌活性的揮發油且研究較為集中的8個科(姜科、樟科、傘形科、菊科、唇形科、蕓香科、禾本科和馬鞭草科)以及對病原菌有較強抑菌活性的主要活性成分進行分類總結。

萜烯類是精油的主要成分。萜烯類化合物來源于許多異戊二烯單元(C5H8)，其連接在一個鏈中，該鏈可能是環狀的，也可能不是環狀的[15]。根據分子中異戊二烯基的數量，萜烯可分為單萜烯類、倍半萜烯或二萜衍生物。單萜烯類由2個異戊二烯單元組成，如檸檬烯、沒藥烯、α-蒎烯和β-蒎烯，它們主要存在于柑橘、姜花、錫蘭肉桂、香樟、月桂、芫荽中(見表1)。倍半萜烯由3個異戊二烯單元組成。β-石竹烯是1種天然的雙環倍半萜，是許多精油的主要成分，特別是在丁香、肉桂、黃花蒿、勝紅薊、百里香的精油中(見表1)。本團隊前期研究以及已發表文獻表明，佛手揮發油、D-檸檬烯和γ-松油烯對三七的3種病原菌(尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌和毀壞柱孢霉)均有效，最低抑菌濃度(MIC)為0.12～12.05 mg·mL-1[16]。其中，D-檸檬烯和γ-松油烯抗菌活性均強于完整精油。黃花蒿揮發油的主成分β-石竹烯，崁烯對尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌抗菌活性強于完整精油[17]。

萜類化合物是一大類天然存在的化合物，在精油中是從異戊二烯單位衍生出來的。但與萜烯不同，萜類化合物中的異戊二烯單元是以許多方式組裝和修飾的，例如添加或除去甲基或在異戊二烯單元中加入氧原子[18]。類似地，萜類化合物可以根據異戊二烯單位的數量分為單萜類、倍半萜類或二萜類，也可以根據其所包含的循環結構的數量進行分類。萜類化合物是一大類抗菌成分，對微生物具有廣譜活性。常見的抗菌萜類化合物有1，8-丁烯醚、芳樟醇、樟腦、乙酸香葉酯、香葉醇、神經醇、萜烯-4-醇和肉桂醛(見表1)。萜類化合物比萜烯類化合物具有更高的抗菌活性，如黃花蒿精油及其萜類成分對尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌抑菌活性均高于佛手揮發油中的萜烯類化合物[16-17]。大多數萜類化合物的抗菌活性與其官能團有關[19]。

酚類化合物是指一類由羥基直接與芳香環結合而成的化合物。酚類包括百里香酚、丁香酚和香芹酚，可在百里香、丁香、肉桂和牛至油中找到 (見表1)。許多研究報道，含有高含量酚類物質的精油具有廣泛的抗菌功效[20]，如丁香酚對25種不同細菌的抗菌活性結果表明，只有1株細菌活性未被抑制[19]。本團隊研究表明，丁香揮發油主成分丁香酚對導致三七根腐病的5種病原真菌(尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、毀壞柱孢霉、腐霉病菌、立枯絲核菌)和2種導致地上部病害的病原真菌(炭疽病菌、灰霉病菌)具有廣譜抑菌活性[21]。其他研究表明，沙丁氏百里香精油的抗菌性能主要與其高含量的香芹酚和百里香酚有關[22]。同樣，2種化學型冬凌草精油對6株革蘭氏陰性菌和3種革蘭氏陽性菌生長的抑菌活性的研究表明，以香芹酚為主的揮發油(75%)的抗菌活性最高，而另一種主要成分為4-萜烯醇(25%)的化學型活性較弱[23]。苯酚的抗菌活性與其羥基有關，苯環的存在增強了酚類化合物的抗菌活性。例如，對傘花烴(p-cymene)有1個不具有羥基的苯環，單獨使用并不是一種有效的抗菌成分[24-25]，抑菌活性差異可能是由于缺乏1個自由的羥基來交換質子，從而抑制了其改變細菌細胞膜完整性的能力。此外，羥基在酚醛環上的相對位置也會影響抗菌效果。如香芹酚比百里香酚和丁香酚對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和蠟狀芽孢桿菌具有更強的抑菌作用[26]。

不同精油的組合或精油的化學成分組合可以產生4種可能的抗菌效果：協同作用、加和作用、無關作用或拮抗作用[27]。因此，有研究對精油組合的有效性進行評估，以提高其抗菌效果，降低農業中農藥的使用水平。混合精油的協同或拮抗作用取決于所測試的精油類型和微生物菌株。筆者前期研究結果表明，將佛手揮發油與化學農藥惡霉靈進行復配，發現惡霉靈與佛手揮發油具有較高的協同效應，分級抑菌濃度指數(FICi)較低 (FICi = 0.31～2.00)[16]。當公丁香揮發油與惡霉靈聯合使用時，對腐霉、灰霉病菌和炭疽菌有協同作用。母丁香揮發油與惡霉靈的組合對鐮刀菌、腐霉菌和灰霉病菌均表現出加和效應[21]。因此，目前很難預測精油混合物的抗菌效果。精油是由多種化合物組成的復雜混合物，各成分之間的相互作用可能會產生協同或拮抗的抗菌作用。總的來說，多項研究得出的結論是，將精油主成分按比例混合時，精油的抗菌活性大于所使用主要成分[28-29]，這表明精油中的次要成分由于具有協同作用，可能對抗菌活性至關重要。

表1中列出了常用的具有抗菌性能的精油的主要成分，大多數具有高抗菌效果的成分是酚類，其次是含氧萜類化合物。精油中的萜烯和其他成分，包括酮和酯類，如香葉烯醋酸牻牛兒酯顯示出較酚類和萜類化合物偏弱的抗菌活性。

表1 不同科屬來源代表性植物抑菌活性

續表1

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3 揮發油可能的抑菌機制

精油的抑菌機制主要取決于精油中化學成分的類型。不同的成分可能通過不同的機制運作，同時，由于不同種類的微生物細胞膜組成不同，如革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌，精油的作用機制也有差異，因為精油中不同的成分可能有不同的或多個靶點[67-68]。因此，很難預測使用精油后微生物的易感程度，以及不同菌株敏感程度不同的原因[69]。研究者將精油的抑菌機制歸因于它們能夠通過微生物細胞外膜和細胞質膜滲透到細胞內部，從而分解細胞結構[69]。此外，精油的某些化學成分特別是酚類，可以作為質子交換劑而具有獨特的抑菌機制，降低細胞質膜的pH梯度，特別是當被其他成分促進時，由此導致的質子驅動力(PMF)的崩潰和三磷酸腺苷(ATP)的耗盡最終導致細胞死亡[68]。當微生物細胞接觸不同的精油時，精油的抗菌活性可能涉及細胞外膜和細胞質內的不同作用。當微生物細胞只接觸到低濃度或亞致死濃度的精油時，細胞膜仍能通過改變脂肪酸飽和程度、碳鏈長度、支鏈位置、順式/反異構化以及不飽和脂肪酸(UFAs)在細胞膜中轉化為環丙烷來保持其流動性[70-71]。一些研究人員研究了精油成分的分子結構對其抗菌活性的影響。萜烯類化合物的抗菌機制發生在細胞膜水平，其抗菌活性被歸因于抑制呼吸和其他能量依賴過程的能力[72]。然而，萜烯類化合物作為單一成分的整體抗菌活性是無效[67]。

揮發油是一種非常復雜的天然混合物，由于多種成分共同起效，其似乎沒有特定的細胞靶點[73]。目前，對揮發油機理的研究較少，所取得的成果有限。提出的機制主要有以下幾個方面：1)影響細胞壁和細胞膜的正常功能。揮發油作為一種典型的親脂性物質，可通過細胞壁和細胞質膜，破壞其不同層的多糖、脂肪酸和磷脂的結構，并使其滲透。細胞壁和細胞膜的損傷可導致細胞質膜、細胞質大分子的滲漏和裂解[74]。通過掃描和透射電鏡觀察到腫脹、皺縮、空泡、質膜和細胞質的滲漏[75]。2)改變能量代謝和還原酶系統。由于揮發油作用下細胞滲透性改變，線粒體和過氧化物酶體也會受到影響，可引起線粒體膜和DNA的損傷。揮發油通過降低膜電位和影響Ca2+循環，誘導線粒體膜去極化[76]。其他離子通道、質子泵和ATP庫也受到影響。膜的流動性會發生變化，最終導致氧化應激和生物能量失效。然而，從揮發油衍生出的各種生物活性組分的大多數可能的作用模式都是間接證據，缺乏系統的基于驗證的研究。由于揮發油是許多分子的復雜混合物，從這個意義上講，為了生物學的目的，研究揮發油比研究其某些成分更能提供更多的信息，因為協同作用的概念似乎更有意義。因此，有必要進行深入、全面地實驗室研究，以確定芳香植物的有效抗菌方式。

4 揮發油系列農藥或肥料產品的開發所面臨的機遇和挑戰

“中醫農業”就是將中醫原理和方法應用于農業領域，實現現代農業與傳統中醫的跨界融合、優勢互補、集成創新。有農用活性的植物資源雖然在早期就被篩選出來，但受到植物自然資源的限制、國民經濟現狀和使用者認知水平的影響，到目前為止，工業化生產中的植物農藥品種仍然很少。植物揮發油來源于自然界，具有良好的環境相容性，是開發無公害農藥的重要資源。目前，植物揮發油在農業抑菌中的應用十分有限，主要應用于醫學領域。對這類植物而言，對揮發油的農業抑菌活性的研究將擴大揮發油資源在農業中的應用。前期筆者開展了大量揮發油的活體實驗，例如，佛手揮發油在連作土壤中對三七進行了進一步的評價，發現與不加揮發油的三七相比，其發病率和病情嚴重程度都有所降低[10]。在公丁香精油噴灑在三七葉片試驗中，公丁香精油與惡霉靈聯用的防治效果達60.77%[21]。黃花蒿石油醚提取物(主要成分與揮發油組成相似)在很大程度上抑制了三七根腐病的發生[17]。生姜揮發油可以顯著抑制三七根腐病害發生率且不影響三七植株的生物量積累[30]。

植物揮發油的化學成分復雜多樣，但抑菌化合物可能只是其中的一種或多種。這些物質之間也可能存在復雜的拮抗或協同效應，這意味著揮發油中的活性化合物需要分離和鑒定，以便為開發新的農藥提供必要的資源。精油的化學分子組成對其抗菌效果起著重要的作用。精油的抑菌活性涉及微生物細胞中的幾個靶點，其中最重要的是細胞膜，細胞膜通常具有滲透性，從而導致細胞成分的泄漏。微乳、納米乳液、脂質體和生物膜等給藥系統已被用于提高精油的抗菌效果和利用。今后的研究需要側重于：1)發現和確定更多的抗菌精油；2)評價不同精油的有效性以及與不同化學農藥組合的協同效應；3)從分子水平上了解精油的抗菌機制，如蛋白質合成、核糖核酸(RNA)合成、脫氧核糖核酸(DNA)合成和中間代謝；4)開發有效的傳遞系統，將精油與其他化學農藥或生物殺菌劑一起封裝，以實現一種協同替代辦法，最大限度地減少化學農藥使用的負面影響，有助于改進、綜合和可持續的病害管理。因此，揮發油具有廣闊的市場發展前景，有可能成為發展綠色農業、降低農業生產成本和出口農業創匯的有力武器。