茯苓抑制小腸收縮的作用機制△

肖洪賀，張明波，郭周全，楊靜嫻

遼寧中醫(yī)藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600

茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.) Wolf的干燥菌核，具有利水滲濕、健脾、寧心等功效。茯苓性平，味甘淡，既能健脾，又能滲濕，常與人參、白術、甘草等配伍，治療脾虛運化失常所致泄瀉，如健脾丸、參苓白術散、四君子湯等健脾類方劑中均配有茯苓[1-3]。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，茯苓提取物能抑制乙酰膽堿刺激的離體小腸痙攣性收縮，并且能有效緩解新斯的明誘導的小鼠胃腸功能亢進[4]，但茯苓抑制小腸收縮的作用機制尚不明確，且未見國內(nèi)外相關文獻報道。

分子對接(molecular docking)是一種利用計算機模擬配體(蛋白質(zhì)、DNA/RNA、小分子)與受體生物大分子相互結(jié)合，根據(jù)計算得出的物理化學參數(shù)來預測其結(jié)合模式及親合力的方法[5]。利用分子對接技術可以從化合物庫中篩選出具有一定生物活性的候選化合物，特別適合從中藥復雜成分中篩選出可能的有效成分，進而從分子層面揭示中藥的物質(zhì)基礎和作用機制[6]。

本實驗采用離體小腸灌流技術，觀察茯苓對小鼠離體小腸自發(fā)收縮以及不同工具藥刺激下的小腸收縮的拮抗作用，并比較阻斷M受體前后茯苓抑制小腸收縮作用的差異；利用分子對接技術將茯苓中33個化合物與M受體進行對接打分，篩選得到能夠結(jié)合M受體的有效成分，進而從分子層面分析茯苓抑制小腸收縮的作用機制及主要活性成分，為茯苓健脾功效的研究與應用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

茯苓購自河北亞寶藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地云南，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學康廷國教授鑒定為多孔菌科真菌茯苓P.cocos(Schw.) Wolf的干燥菌核。

氯化乙酰膽堿(acetylcholine，Ach，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：A111014)；硫酸阿托品(atropine，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：A109524)；無水乙醇(分析純，南京化學試劑有限公司)；聚山梨酯-80(南京化學試劑有限公司)；氯化鋇(BaCl2)和氯化鈣(CaCl2)均為分析純。

1.2 儀器

RM6240B型多道生理信號采集系統(tǒng)(成都儀器廠)；電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；501型恒溫水浴鍋(金壇市白塔新寶儀器廠)；JJ224BC型分析天平(常熟市雙杰測試儀器廠)；DFT-50型中藥粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)。

1.3 實驗動物

SPF級雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購自遼寧長生生物技術有限公司，合格證號：SCXK(遼)2015-0001。

2 方法

2.1 茯苓提取液的制備

茯苓飲片粉碎，過60目篩，稱取80 g，加8倍量50%乙醇溶液，浸泡1 h，回流1 h，趁熱抽濾，濾渣加6倍量50%乙醇溶液，回流1 h，趁熱抽濾，合并2次濾液，60 ℃水浴濃縮，以2%的聚山梨酯-80水溶液配成2 g·mL-1的茯苓提取液(按生藥量計算)，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 腸管標本的制備與收縮曲線記錄

參照文獻方法[7]，小鼠禁食12 h(自由飲水)，脫頸處死后迅速剪開腹腔，剪取回腸部位腸段，剝離腸系膜后按1 cm長度剪成數(shù)段，臺氏液清洗內(nèi)容物，兩端穿線，置于盛有80 mL臺氏液的麥氏浴槽中，一端連于接張力換能器，一端固定于L形通氣鉤，溫度控制在(37±0.2)℃，持續(xù)通入空氣。設置腸管預負荷1～1.5 g，待恢復自發(fā)收縮后，將收縮曲線波谷調(diào)至基線，記錄自發(fā)收縮曲線5 min。

2.3 茯苓對小鼠離體小腸自發(fā)活動的影響

記錄自發(fā)收縮曲線后，分別依次加入茯苓提取液20、20、40、80、160、320、640 μL，每個濃度作用5 min，記錄收縮曲線，溶媒組加入等體積2%聚山梨酯-80，根據(jù)公式(1)計算平均肌張力抑制率，平均肌張力即為收縮波形曲線下面積[8]。

平均肌張力抑制率=(茯苓給藥后的平均肌張力-
自發(fā)收縮時的平均肌張力)/
自發(fā)收縮時的平均肌張力×100%

(1)

2.4 茯苓對Ach、BaCl2和CaCl2刺激下的離體小腸收縮的影響

記錄自發(fā)收縮曲線后，分別加入Ach(終濃度為7.5×10-7mol·L-1)、BaCl2(終濃度為1.56×10-4mol·L-1)、CaCl2(終濃度為1.39×10-5mol·L-1)，作用10 min后，分別依次加入茯苓提取液20、20、40、80、160、320、640 μL，每個濃度作用5 min，記錄收縮曲線，根據(jù)公式(2)計算平均肌張力抑制率。CaCl2組采用無鈣臺氏液，溶媒組加入等體積2% TW-80水溶液。

平均肌張力抑制率=(工具藥刺激后的平均肌張力-
茯苓給藥后的平均肌張力)/
工具藥刺激后的平均肌張力×100%

(2)

2.5 M受體對茯苓抑制離體小腸收縮的影響

記錄自發(fā)收縮曲線后，加入硫酸阿托品(終濃度為8.69×10-6mol·L-1)孵育5 min以阻斷M受體，然后加入Ach(終濃度為7.5×10-7mol·L-1)使腸管收縮，作用10 min后，依次加入茯苓提取液20、20、40、80、160、320、640 μL，每個濃度作用5 min，記錄腸管收縮曲線，計算平均肌張力抑制率，比較阻斷M受體前后茯苓拮抗小腸收縮的作用差異。

2.6 茯苓所含化學成分與M受體的分子對接

查閱文獻收集得到茯苓中33個化學成分，利用Chemdraw畫出結(jié)構式，利用Chem3D將結(jié)構式轉(zhuǎn)換成為三維結(jié)構，采用MM2力場對其進行結(jié)構優(yōu)化，借助Autodock Tool將33個化合物加氫、加電荷后轉(zhuǎn)成Autodock文件(pqbqt)格式，建立可供篩選的化合物數(shù)據(jù)庫。從PDB數(shù)據(jù)庫下載M受體的結(jié)構文件(ID為3UON)[9]，利用Discovery Studio從蛋白晶體復合物中提取原配體分子，配體分子和受體大分子分別進行加極性氫、賦予電荷，采用Autodock Vina V1.1.2 軟件將M受體與原配體重新對接，Grid box范圍設定為28 nm×28 nm×28 nm，中心坐標為(X：8.73，Y：-0.02，Z：-3.06)。采用Autodock Vina V1.1.2對茯苓中33個化合物和M受體進行虛擬對接，對接過程中，只改變配體的構象，而保持蛋白構象不變，其余所有參數(shù)均采用默認值。另外選取4個M受體拮抗劑作為陽性對照進行對接打分，名稱及結(jié)構見圖1。

圖1 M受體拮抗劑的名稱及結(jié)構式

3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

4 結(jié)果

4.1 茯苓對小鼠離體小腸自發(fā)活動的影響

如圖2A所示，離體腸管經(jīng)過10～15 min后恢復自發(fā)收縮，呈現(xiàn)良好的節(jié)律性。累積加入溶媒持續(xù)作用60 min，仍保持良好的活性，腸管活力與實驗開始時無明顯減弱，說明本實驗方法可靠。如圖2B所示，腸管恢復自發(fā)性收縮后，累積加入0.5～32 g·L-1茯苓提取液，腸管收縮基線逐漸降低，收縮幅度逐漸減小，平均肌張力(即收縮曲線下面積)逐漸降低，并呈現(xiàn)劑量依賴性關系。當茯苓質(zhì)量濃度增至32 g·L-1時，平均肌張力抑制率達到(181.92±47.75)%(見圖3)，說明茯苓能夠顯著抑制小腸自發(fā)性收縮。

注：A.溶媒組；B.茯苓組。圖2 茯苓對離體小腸自發(fā)活動波形的影響

注：與2%聚山梨酯-80組比較，**P<0.01。圖3 茯苓對離體小腸自發(fā)活動平均肌張力的影響

4.2 茯苓對Ach、BaCl2和CaCl2所致的離體小腸痙攣性收縮的影響

如圖4所示，恢復自發(fā)收縮的離體腸管，在給予Ach、BaCl2或CaCl2后，小腸收縮波形基線明顯抬高，給予0.5～32 g·L-1的茯苓提取液可明顯降低波形基線，并劑量依賴性抑制小腸平均肌張力，與溶媒組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01，見圖5)，說明茯苓能夠有效抑制Ach、BaCl2或CaCl2引起的小鼠離體小腸痙攣性收縮，而對Ach的抑制作用最強，所以后續(xù)實驗選擇M受體進行研究。

注：A.Ach組；B.BaCl2組；C.CaCl2組。圖4 茯苓對Ach、BaCl2和CaCl2所致的離體小腸痙攣性收縮波形的影響

注：與2%聚山梨酯-80組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖5 茯苓對Ach、BaCl2和CaCl2所致的離體小腸痙攣性收縮平均肌張力的影響

4.3 M受體對茯苓抑制離體小腸收縮的影響

小鼠離體小腸恢復自發(fā)收縮后，給予Ach刺激，收縮基線立即抬高，小腸呈現(xiàn)痙攣性收縮；給予茯苓后，小腸的收縮幅度和收縮基線迅速降低。事先給予硫酸阿托品阻斷M受體，茯苓對小腸收縮的抑制作用明顯減弱(見圖6)，與未給予硫酸阿托品的Ach+茯苓組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖7)，說明茯苓抑制小腸收縮的作用與M受體有關。

注：A.溶媒組；B.Ach+茯苓組；C.Atropine+Ach+茯苓組。圖6 M受體對茯苓抑制離體小腸收縮波形的影響

注：與2%聚山梨酯-80組比較，*P<0.05,**P<0.01;與Ach+茯苓組比較，#P<0.05,##P<0.01。圖7 M受體對茯苓抑制離體小腸平均肌張力的影響

4.4 茯苓成分與M受體對接的結(jié)果

茯苓中的齒孔酸、松苓酸A、3-氫化松苓酸、麥角甾醇等成分能夠與M受體結(jié)合，結(jié)合能分別為-9.3、-9.2、-9.1、-8.6 kcal·mol-1，均低于M受體阻滯劑阿托品、異丙托溴銨、哌侖西平、托特羅定與M受體的結(jié)合能，說明茯苓中的活性成分能夠與M受體結(jié)合，阻斷M受體的生物學功能(見表1)。齒孔酸、松苓酸A和3-氫化松苓酸與M受體主要以

表1 茯苓33個成分及M受體阻滯劑與M受體的結(jié)合能力 kcal·mol-1

注：A、B.齒孔酸；C、D.松苓酸A；E、F.3-氫化松苓酸。圖8 茯苓代表性成分與M受體相互作用

氫鍵和疏水作用結(jié)合(見圖8)。齒孔酸與M受體的TYR83形成氫鍵，與TRP422、PHE181形成疏水作用(見圖8A～B)；松苓酸A與M受體的THR187形成氫鍵，與TRP422、TRP99、TYR426、TYR177、LEUA100形成疏水作用(見圖8C～D)；3-氫化松苓酸與M受體主要以氫鍵和疏水作用結(jié)合，與M受體的TYR83、ASN491、PHE181形成氫鍵，與TRP422、TRP426和TYR80形成疏水作用(見圖8E～F)。

5 討論

胃腸動力的異常能夠引起許多胃腸疾病，如最常見的功能性胃腸道疾病——腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)。IBS患者的內(nèi)臟靈敏性異常升高，腦腸肽水平也處于異常狀態(tài)[10]。腹瀉型IBS患者小腸轉(zhuǎn)運速度過快，營養(yǎng)物質(zhì)來不及吸收就被轉(zhuǎn)運至結(jié)腸，導致結(jié)腸內(nèi)產(chǎn)氣增加；而便秘型IBS患者小腸運轉(zhuǎn)速度過慢，水分被過度吸收而致便秘[11]。所以調(diào)節(jié)小腸蠕動功能，有可能是治療腹瀉型IBS的有效途徑。

小腸的蠕動依賴于小腸平滑肌的電生理活動。動作電位直接引起平滑肌的收縮，慢波電位本身不引起收縮，但是可以引發(fā)動作電位，進而調(diào)控平滑肌的收縮節(jié)律和運動功能[12]。小腸平滑肌的運動受到神經(jīng)和體液的調(diào)節(jié)，其中膽堿能神經(jīng)元及相應受體對胃腸活動的調(diào)節(jié)作用至關重要。內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)Ach能夠激活小腸平滑肌的M膽堿能受體，使胞內(nèi)三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘油(DG)水平升高。IP3作為第二信使與IP3受體結(jié)合，使肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)貯存的高濃度Ca2+迅速釋放到胞漿中，進而啟動平滑肌興奮-收縮偶聯(lián)，引起平滑肌收縮。此外，胃腸平滑肌上還存在組胺和5-羥色胺等受體，以及鈣離子通道、鉀離子通道和鈉離子通道，共同調(diào)節(jié)胃腸平滑肌的動力功能[13-16]。

茯苓是常見的健脾利濕中藥，其健脾作用多與調(diào)節(jié)胃腸道蠕動功能有關。已有研究表明，茯苓水提液能夠抑制正常小鼠胃排空和小腸推進[17]，茯苓粗提物能夠舒張家兔離體空腸和盲腸[18]。離體灌流結(jié)果顯示，茯苓提取液能夠濃度依賴性地抑制小鼠小腸自主收縮，并顯著抑制Ach引起的小腸痙攣性收縮；當腸管經(jīng)M受體阻滯劑阿托品孵育后，茯苓抑制小腸收縮的作用明顯減弱，與無阿托品孵育組比較差異有統(tǒng)計學意義，說明茯苓需要通過與M受體相互作用才能有效地抑制小腸收縮。

為了進一步驗證茯苓與M受體的相互作用，本研究采用分子對接技術對茯苓中含有的成分與M受體進行虛擬對接。分子對接結(jié)果顯示，茯苓中含有大量能夠與M受體結(jié)合的成分，其中齒孔酸、松苓酸A、3-氫化松苓酸、麥角甾醇、去氫齒孔酮酸與M受體結(jié)合的自由能均低于阿托品、異丙托溴銨等M受體阻滯劑，說明茯苓具備阻斷M受體的物質(zhì)基礎，并且這些能夠與M受體結(jié)合的化合物可能是茯苓抑制小腸收縮的主要活性成分。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，茯苓還能一定程度上抑制BaCl2和CaCl2引起的小腸痙攣性收縮。BaCl2是平滑肌內(nèi)向整流鉀通道阻滯劑，能夠通過阻斷內(nèi)向整流鉀通道引起細胞膜去極化，激活電壓依賴性Ca2+通道，使胞外Ca2+進入胞內(nèi)，導致平滑肌收縮[19-21]。茯苓能夠抑制BaCl2、CaCl2引起的小腸痙攣性收縮，說明茯苓除了能阻斷M受體外，還能通過調(diào)節(jié)鉀通道和鈣通道活性而發(fā)揮舒張小腸平滑肌的作用，這也契合了中藥多成分、多靶點、多途徑的作用特點。

綜上，本研究結(jié)合小腸灌流技術和分子對接技術，考察了茯苓對離體小腸收縮抑制作用及其機制，發(fā)現(xiàn)茯苓能夠通過抑制M受體，并調(diào)節(jié)鉀通道和鈣通道抑制小腸的自發(fā)收縮和痙攣性收縮；齒孔酸、松苓酸A、3-氫化松苓酸、麥角甾醇、去氫齒孔酮酸能夠與M受體結(jié)合，可能是茯苓阻斷M受體、抑制小腸收縮的主要活性成分。本研究為茯苓的健脾活性及治療IBS等胃腸道疾病的應用提供了實驗依據(jù)，關于茯苓調(diào)節(jié)鉀通道和鈣通道的具體機制還有待進一步研究。